Caracterización genómica y funcional del catabolismo de hidrocarburos aromáticos en la bacteria marina Alcaligenes aquatilis QD168 y estudio de la respuesta adaptativa a estrés oxidativo durante la degradación de benceno

Abstract

El empleo masivo de derivados del petróleo ha causado eventos de contaminación a nivel mundial, impactando suelos, sedimentos, aguas y sus ecosistemas cercanos. Dentro de los componentes del petróleo, la fracción aromáticos es la más tóxica y recalcitrante de sus componentes. Sedimentos marinos contaminados con petróleo y sus derivados son nichos de bacterias capaces de degradar hidrocarburos aromáticos. El catabolismo aerobio de estos compuestos es realizado mediante reacciones de oxigenación que permiten la activación y apertura del anillo aromático. Durante la degradación de compuestos aromáticos, se ha observado una respuesta adaptativa a estrés oxidativo. Sin embargo, la respuesta bacteriana de estrés oxidativo durante la degradación de compuestos aromáticos ha sido poco caracterizada. Alcaligenes sp. QD168 es una bacteria hidrocarbonoclástica aislada desde sedimentos marinos contaminados con petróleo de la Bahía de Quintero, Región de Valparaíso. En esta tesis, se identificaron los genes que codifican proteínas asociadas a rutas catabólicas de compuestos aromáticos y a la respuesta adaptativa a estrés oxidativo en Alcaligenes sp. QD168, como también se estudió la respuesta a estrés oxidativo durante la degradación del hidrocarburo aromático benceno. Se secuenció el genoma de Alcaligenes-sp. QD168 obteniendo un cromosoma de 4,32 Mb con un contenido GC de 56.4%. La identificación taxonómica mediante ARNr 16S, MLSA y análisis de identidad nucleotídica promedio (ANI) permitió clasificar a la cepa QD168 como Alcaligenes aquatilis, perteneciendo esta especie al grupo filogenómico III luego de comparar 26 genomas del género Alcaligenes. Al analizar el genoma de la cepa QD168 se identificaron 7 rutas centrales (e.g., ruta del catecol) y 16 rutas/reacciones periféricas (e.g., ruta del benceno) para la degradación de compuestos aromáticos, además de 30 genes que participan en la respuesta a estrés oxidativo, incluyendo reguladores transcripcionales (oxyR, soxR, perR), enzimas antioxidantes (ahpC, katE, sodC) e isoenzimas resistentes a estrés oxidativo (fumC). Se observó crecimiento en 14 compuestos (e.g., benceno, nicotinato, cinamato), corroborando algunas rutas predichas in silico. Para estudiar la respuesta a estrés oxidativo en la cepa QD168, se seleccionó el compuesto modelo benceno. Se determinó la cinética de crecimiento y la degradación de benceno por la bacteria A. aquatilis QD168, identificando la aparición del intermediario metabólico fenol. Análisis de la expresión génica durante el crecimiento de la cepa QD168 en benceno reveló un alto aumento en los transcritos de los genes que codifican las enzimas fenol hidroxilasa (dmpP) y catecol 1,2-dioxigenasa (catA). Ensayos de TBARS y carbonilación revelaron daño a membrana y proteínas frente a la exposición a H2O2 y paraquat. Durante la degradación de benceno por la cepa QD168 se observó daño a membrana y proteínas, y un aumento de los niveles transcripcionales de los genes asociados a la respuesta adaptativa a estrés oxidativo ahpC1, ahpC2, fumC, oxyR, soxR2. Estos resultados indican que el crecimiento en benceno provoca daño a macromoléculas y una respuesta adaptativa a estrés oxidativo en A. aquatilis QD168. Esta tesis revela el potencial de A. aquatilis QD168 para sobrevivir ambientes contaminados, identificando un gran repertorio enzimático para la degradación de compuestos aromáticos y una amplia respuesta adaptativa ante el catabolismo aerobio de estos compuestos, convirtiéndola en una buena candidata para la biorremediación de ambientes marinos y salinos contaminados con hidrocarburos aromáticos

High demand of crude-oil has caused pollution events worldwide, impacting soil, sediments and water matrices, as well as their surrounding environments. Petroleum aromatic hydrocarbons are the most toxic and recalcitrant fraction found in crude-oil. Crude oil-polluted marine sediments are niches of bacteria capable of degrading aromatic hydrocarbons. Aerobic catabolism of aromatic compounds is carried out through oxygenation reactions allowing the activation and cleavage of the aromatic ring. During aromatic compounds degradation, the induction of an oxidative stress response has been detected. However, the bacterial response of oxidative stress observed during the degradation of aromatic compounds has been poorly characterized. Alcaligenes sp. QD168 is a hydrocarbonoclastic bacterium isolated from marine sediments polluted with crude-oil from the Quintero Bay, Valparaíso Region. In this thesis, the genes encoding catabolic pathways of aromatic compounds and oxidative stress response were identified in the marine bacterium Alcaligenes sp. QD168, as well as the study of the oxidative stress response during degradation of the aromatic hydrocarbon benzene. The complete genome of Alcaligenes sp. QD168 was sequenced, obtaining a chromosome of 4.32 Mb with a GC content of 56.4%. The taxonomic identification by 16S rRNA, MLSA and analysis of average nucleotide identity (ANI) allowed classification of the strain QD168 as Alcaligenes aquatilis, belonging to the phylogenomic group III after analysing 26 genomes of the genus Alcaligenes. Genome mining of strain QD168 identified 7 central pathways (e.g., catechol route) and 16 pathways/peripheral reactions (e.g., benzene pathway) for the degradation of aromatic compounds, in addition to 30 genes involved in the oxidative stress response: including transcriptional regulators (oxyR, soxR, perR); antioxidant enzymes (ahpC, katE, sodC) and isoenzymes resistant to oxidative stress (fumC). Strain QD168 growth was observed on 13 compounds, corroborating some of the predicted pathways in silico. To study the oxidative stress response in strain QD168, benzene was chosen as the model aromatic compound. Growth kinetics and degradation of benzene by A. aquatilis QD168 were determined, identifying the metabolic intermediate phenol by high-performance liquid chromatography. Analysis of gene expression during strain QD168 growth on benzene, showed a large increase in the transcripts of genes encoding the enzymes phenol hydroxylase (dmpP) and catechol 1,2-dioxygenase (catA). TBARS and carbonylation assays revealed membrane and protein damage, respectively, during exposure to H2O2 and PQ. During benzene degradation by strain QD168, membrane and protein damage was observed, as well as an increase in transcriptional levels of the oxidative stress genes: ahpC1, ahpC2, fumC, oxyR and soxR2. These results indicate that strain QD168 growth on benzene causes macromolecule damage and an increase in oxidative stress response. These results emphasised A. aquatilis QD168 potential to overcome polluted environments, identifying a large enzymatic repertoire for the degradation of aromatic compounds and a broad adaptive response to aerobic catabolism of these compounds, which can be suitable for the bioremediation of marine and saline environments polluted with aromatic hydrocarbons