Contribución de los efectores SipA, SseF y SseG en la supervivencia intracelular de Salmonella enterica serovar Typhimurium en Dictyostelium discoideum

Abstract

Salmonella es un género de bacterias Gram-negativo responsable de millones de casos de infecciones asociadas a alimentos a nivel mundial. Estas infecciones generan cuadros clínicos que abarcan desde una enteritis autolimitada hasta cuadros infecciosos sistémicos que pueden causar la muerte del hospedero. Su ciclo infectivo contempla el ingreso del patógeno al organismo vía agua o alimentos contaminados, resistiendo el ambiente ácido del estómago y colonizando el intestino delgado. Para su patogenicidad, la bacteria requiere de numerosos factores de virulencia, incluyendo los sistemas de secreción de tipo 3 codificados en las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2 (T3SS-1 y T3SS-2, respectivamente) y sus proteínas efectoras, los que le permiten infectar las células epiteliales y poder sobrevivir dentro de ellas y de células fagocíticas. Dentro de estas proteínas efectoras se encuentran SipA, SseF y SseG, que participan en la supervivencia intracelular de la bacteria contribuyendo al correcto desarrollo de la “vacuola contenedora de Salmonella” en células de mamífero, compartimento que permite la replicación intracelular del patógeno. Por otra parte, Salmonella también suele encontrarse en el medio ambiente, donde interactúa con diferentes protozoos depredadores de bacterias. Naturalmente, la bacteria ha desarrollado estrategias para sobrevivir dentro de estos organismos, quedando protegida de condiciones medioambientales desfavorables y transformando a los protozoos en un importante reservorio ambiental. Incluso, se ha propuesto que la interacción con estos protozoos le ha permitido a Salmonella adquirir herramientas para adaptarse al ambiente intracelular de células fagocíticas humanas. A pesar de esto, hasta la fecha se han realizado pocos estudios para caracterizar esta interacción. Al respecto, nuestro grupo reportó que Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) puede sobrevivir dentro de la ameba Dictyostelium discoideum, organismo ampliamente usado como modelo de estudio de interacción entre bacterias y protozoos, y que necesita de los T3SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-1 y SPI-2 para sobrevivir intracelularmente. Sumado a lo anterior, se observó que la bacteria también reside dentro de una estructura vacuolar dentro de D. discoideum. Considerando lo anterior, en esta tesis investigamos el rol de los efectores SipA, SseF y SseG en la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en D. discoideum mediante ensayos de infección. También se realizaron ensayos para determinar si estos efectores son producidos y secretados dentro de la ameba. Finalmente, se realizó un seguimiento mediante microscopía confocal para analizar si los efectores en estudio participan en la capacidad de S. Typhimurium para residir dentro de la estructura vacuolar mencionada. Para evaluar la supervivencia intracelular, se construyeron las cepas mutantes ΔsipA, ΔsseF, ΔsseG y ΔsseFG derivadas de S. Typhimurium 14028s, las que carecen de los genes sipA, sseF, sseG, o de sseF y sseG simultáneamente. La supervivencia intracelular de cada cepa se evaluó infectando la ameba y determinando el título de bacterias intracelulares a distintos tiempos post infección. Nuestros resultados mostraron que las mutantes ΔsseF y ΔsseFG presentan una mayor internalización en la ameba en comparación a la cepa silvestre. Además, ΔsipA presenta defectos de supervivencia intracelular a 1 h, ΔsseF a 3 h, ΔsseG a 6 h y ΔsseFG a 3 h y 6 h post infección, en comparación a la cepa silvestre. Estos resultados sugieren que los efectores SipA, SseF y SseG contribuyen a la supervivencia de S. Typhimurium en D. discoideum de manera diferencial durante el transcurso de la infección. Para evaluar si los efectores en estudio son producidos y secretados intracelularmente en D. discoideum se construyeron cepas que presentan una fusión traduccional de cada efector al reportero CyaA’, utilizando su actividad adenilato ciclasa dependiente de calmodulina para determinar si los efectores son translocados al citoplasma de D. discoideum en el transcurso de una infección. Si bien fue posible inmunodetectar las proteínas de fusión en lisados totales bacterianos y también se pudo detectar actividad adenilato ciclasa de la proteína SipA-CyaA’ en un ensayo de infección en células HeLa, no se detectó actividad adenilato ciclasa en infecciones en D. discoideum. Estos resultados sugieren que con la metodología escogida no es posible detectar translocación de efectores al citoplasma de D. discoideum. Para analizar si los efectores en estudio participan en la localización de S. Typhimurium en un compartimento vacuolar de D. discoideum, se infectó una cepa de la ameba que expresa una fusión de la ATPasa vacuolar VatM a GFP con las mutantes ΔsipA, ΔsseF, ΔsseG y ΔsseFG, que además expresan constitutivamente mCherry. Cada infección se observó en el microscopio confocal a distintos tiempos y se determinó el porcentaje de bacterias que residen dentro de estructuras vacuolares que presentan fluorescencia verde. Nuestros resultados mostraron que luego de 1 h post infección, la cepa ΔsseFG reside mayoritariamente fuera de estas estructuras vacuolares en comparación con la cepa silvestre, mientras que luego de 3 h post infección las cepas ΔsseF y ΔsseG son las que presentan este fenotipo. Finalmente, luego de 6 h post infección ninguna cepa presenta diferencias con el fenotipo observado en la cepa silvestre. Estas observaciones sugieren que los efectores SseF y SseG contribuyen a la capacidad de la bacteria para residir en compartimentos vacuolares dentro de esta ameba. En conjunto, los resultados obtenidos en esta tesis contribuyen a entender de mejor manera los mecanismos por los que Salmonella logra sobrevivir intracelularmente en amebas, contribuyendo al posible desarrollo de nuevas estrategias para controlar las infecciones causadas mundialmente por este patógeno

Salmonella is a genus of Gram-negative bacteria responsible of millions of foodborne illness globally. These infections generate clinical manifestations ranging from self-limited enteritis to systemic infections that can lead to the death of the host. The infectious cycle of Salmonella begins with the ingestion of the pathogen via contaminated water and food. The pathogen can resist the stomach acidity and then colonizes the small intestine. For these processes the pathogen requires numerous virulence factors, including Type 3 secretion systems that are encoded in the pathogenicity islands SPI-1 and SPI-2 (T3SS-1 and T3SS- 2, respectively) and their cognate effector proteins, which grants the bacteria the ability to infect and survive within epithelial cells and phagocytic cells. The effector proteins SipA, SseF and SseG participate in the intracellular survival of this bacteria, contributing to the development of the “Salmonella-containing vacuole” in mammal cells, compartment that allows intracellular replication of the pathogen. Although Salmonella is an intracellular pathogen, it spends a substantial part of its life cycle in the environment interacting with different predatory protozoa that feeds on bacteria. As one may espect, the bacterium has developed strategies to survive inside these organisms, being protected from adverse environmental conditions. As a result, protozoa may act as environmental reservoirs for this pathogen. It has been proposed that this interaction has allowed Salmonella to acquire molecular mechanisms to adapt to the intracellular environment of human phagocytic cells. However, only a few studies have been conducted up to date in order to characterize this interaction. In spite of this, our laboratory reported that Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) is able to survive inside the social amoeba Dictyostelium discoideum, a model organism widely used to study amoeba-bacteria interaction, and requires T3SS-1 and T3SS-2 for this process. Additionally, we observed that the pathogen resides within vacuolar structures in D. discoideum. In this thesis we studied the role played by SipA, SseF and SseG in the intracellular survival of S. Typhimurium in D. discoideum by infection assays. We also determined if these effectors are produced and secreted inside the amoeba. Finally, we analyzed by confocal microscopy whether the effectors under study participate in the ability of S. Typhimurium to reside within the aforementioned vacuolar structure in D. discoideum. To evaluate intracellular survival, ΔsipA, ΔsseF, ΔsseG and ΔsseFG mutant strains derived from S. Typhimurium 14028s were constructed. Intracellular survival of each strain was assessed by infecting the amoeba and calculating the intracellular bacterial titer at different postinfection times. Our results showed that mutants ΔsseF and ΔsseFG exhibit increased internalization in the amoeba as compared with the wild-type strain. In addition, ΔsipA exhibits intracellular survival defects at 1 h, ΔsseF at 3 h, ΔsseG at 6 h and ΔsseFG at 3 h and 6 h post infection, as compared with the wild-type strain. These results suggest that effector proteins SipA, SseF and SseG contribute to S. Typhimurium survival within D. discoideum during infection. To assess whether the studied effector proteins are produced and secreted intracellularly in D. discoideum, we constructed mutant strains that carry a translational fusion of the effectors to the CyaA’ reporter and used its calmoduline-dependent adenylate cyclase activity to determine whether the effectors are translocated into the cytoplasm of D. discoideum during infection. While it was possible to immunodetect the fusion proteins in whole-cell lysates, and to detect adenylate cyclase activity of the SipA-CyaA’ fusion protein in infected HeLa cells, we were not able to detect adenylate cyclase activity in D. discoideum infections. These results suggest that it is not possible to detect translocation of effectors to the cytoplasm of D. discoideum with the chosen methodology. To analyze whether the effectors under study participate in the localization of S. Typhimurium in a vacuolar compartment in D. discoideum, a strain of the amoeba carrying a fusion of the vacuolar ATPase VatM to GFP was infected with ΔsipA, ΔsseF, ΔsseG and ΔsseFG mutants, which also carry a plasmid that allows the constitutive expression of the mCherry protein. Each infection was monitored by confocal microscopy at different infection times and the percentage of bacteria within vacuolar sctructures exhibiting green fluorescence was determined. Our results showed that the strain ΔsseFG mostly resides outside the vacuolar structure at 1 h post infection. At 3 h post infection, the strains ΔsseF and ΔsseG showed this phenotype. Finally, at 6 h post infection no strains show differences in comparison to the wild-type strain. These observations suggest that effectors SseF and SseG contribute to the ability of the bacterium to reside in vacuolar compartments within this amoeba. Overall, the results obtained in this thesis contribute to a better understanding of the mechanisms by which Salmonella survive intracellularly in amoebae, contributing to the possible development of novel strategies to control the infections caused by this pathogen worldwide