Efecto de la oxidación mediada por radicales peroxilo sobre la capacidad polimérica de la proteína FtsZ del termófilo Methanocaldococcus jannaschii

Abstract

La oxidación e inactivación de FtsZ es de interés biológico debido al papel clave de esta proteína en la división celular bacteriana. Caracterizamos la oxidación mediada por radicales peroxilo derivados de AAPH (diclorhidrato de 2,2'-azobis(2-metilpropionamidina)) de la proteína FtsZ del termófilo M. jannaschii (MjFtsZ). La proteína MjFtsZ posee once residuos de Met, un residuo de Tyr y un residuo de Trp que son susceptibles a la oxidación por radicales peroxilo. Este microorganismo es capaz de replicarse en un ecosistema que posee altas cantidades de agentes oxidantes. Por lo que, nuestra hipótesis es que la proteína FtsZ de este microorganismo termófilo posee una mayor estabilidad frente a radicales peroxilo (ROO•) que la proteína FtsZ de las bacterias mesófilas. La incubaión de MjFtsZ con AAPH (a una concentración de 10 o 100 mM) a 37 ºC durante 3 horas provocaron: La pérdida de la actividad polimérica, afectando el perfil de polimerización/despolimerización, que se evaluó mediante dispersión de luz; además produjo niveles bajos de dímeros covalentes irreversibles, que se analizaron mediante SDS-PAGE y SEC. El consumo de aminoácidos se cuantificó mediante HPLC con detección de fluorescencia o fluorescencia directa (para el residuos de Trp). Los productos de oxidación y las modificaciones en los residuos de Met individuales se cuantificaron mediante UPLC con detector de masas. Con AAPH 10 mM solo se consumieron Trp y Met dando di-alcoholes, quinurenina y di-Trp (de Trp) y el sulfóxido (de Met). En presencia de AAPH 100 mM también se observaron niveles bajos de oxidación de Tyr (pero no formación de di-Tyr). La correlación con los análisis funcionales indica que la oxidación de Met, y en particular Met164, es el factor clave de la inactivación de MjFtsZ, probablemente como resultado de la posición de este residuo en la interfaz proteína-proteína de interacciones longitudinales y muy cerca del sitio de unión de GTP

The oxidation and inactivation of FtsZ is of interest due to the key role of this protein in bacterial cell division. We characterized the oxidation, mediated by peroxyl radicals (ROO•) derived from AAPH (2,2-'azobis(2-methylpropionamidine) dihydrochloride), of the FtsZ protein of the thermophile M. jannaschii (MjFtsZ). The MjFtsZ protein has eleven Met residues, a single Tyr residue and Trp residue that are susceptible to oxidation by ROO•. This microorganism is capable of replicating itself in an ecosystem that has high amounts of oxidizing agents. Therefore, our hypothesis is that the FtsZ protein of this thermophilic microorganism has greater stability against ROO• than the FtsZ protein of mesophilic bacteria. The incubation of MjFtsZ with AAPH (at 10 or 100 mM) at 37 ºC for 3 horas caused: The loss of polymeric activity, affecting the polymerization/depolymerization profile, which was evaluated by light scattering; it also produced low levels of irreversible covalent dimers, which were analyzed by SDS-PAGE and SEC. Amino acid consumption was quantified by HPLC with fluorescence detection or direct fluorescence (for Trp residues). The oxidation products and the modifications at individual Met residues were quantified by UPLC with mass detection. With 10 mM AAPH only Trp and Met were consumed giving di-alcohols, quinurenine and di-Trp (from Trp) and the sulfoxide (from Met). In the presence of 100 mM AAPH low levels of Tyr oxidation (but no di-Tyr formation) were also observed. Correlation of these results with the functional analyzes indicates that the oxidation of Met, in particular Met164, is the key factor in the inactivation of MjFtsZ. This probably resulting from the location of this residue in the protein-protein interface of longitudinal interactions and very close to the GTP binding site