Asociación del eje IL-7/IL-7R con la gravedad en adultos con neumonía adquirida en la comunidad

Abstract

Introducción: La neumonía adquirida en la comunidad (NAC) es un proceso inflamatorio pulmonar agudo generado por bacterias y/o virus adquiridos en el medio comunitario con una importante tasa de morbilidad y mortalidad. Hay escalas clínicas de gravedad, como PSI o CURB-65, que predicen el riesgo de mortalidad y orientan el tratamiento clínico del paciente. Estas escalas tienen limitaciones, por lo que se han investigado biomarcadores que predigan la evolución de esta enfermedad, la cual depende más de la respuesta inmune del hospedero que del agente infeccioso en adultos. Estudios previos en adultos con NAC y sin inmunodeficiencia conocida mostraron una disminución en el recuento de linfocitos T (LT) CD4+ y en la expresión génica de Il7r (subunidad alfa del receptor de interleuquina 7, IL-7Rα) en los enfermos graves respecto a los leves. IL-7R es un receptor crucial en el desarrollo, sobrevida y proliferación de LT. Polimorfismos de un nucleótido (SNPs: c.731C>T, c.801-21A>T, c.1066A>G) de este receptor están relacionados con enfermedades infecciosas y autoinmunes, mediante la generación de la isoforma soluble de este receptor (IL-7Rs), que regula la vía de señalización del eje IL-7/IL-7R. Esta vía no ha sido estudiada en NAC. Objetivo: Evaluar si la frecuencia alélica y genotípica de los polimorfismos c.731 C>T, c.801-21 A>T y c.1066 A>G; la expresión génica de Il7r; el porcentaje de células que expresan IL-7R; la concentración plasmática de IL-7R soluble y su ligando IL-7 difieren entre adultos con neumonía adquirida en la comunidad con distinta evolución clínica. Metodología: Se enrolaron 202 adultos hospitalizados con NAC en tres hospitales de Santiago (Hospital Clínico de la Universidad de Chile, de Enfermedades Infecciosas Dr. Lucio Córdova y Complejo Hospitalario San José) entre mayo 2017 y agosto 2019. Se pesquisaron antígenos de S. pneumoniae y Legionella en orina mediante Binax®, así como genoma de virus y bacterias atípicas en muestras respiratorias por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (PCR-tr) (Argene®). En muestras de sangre venosa periférica se hicieron los análisis de IL-7R y su eje de señalización. La genotipificación de los SNPs c.731 C>T y c.1066 A>G se realizó mediante PCR-tr con curva de fusión de alta resolución, mientras que para c-801-21 A>T se utilizó PCR-tr alelo específico. La expresión relativa (veces de cambio: Vc) del gen Il7r en ARN de sangre se determinó mediante transcripción inversa y PCR-tr. Los recuentos de LT (CD3+) y los que expresan IL-7Rα (CD3+CD127+) se determinaron mediante citometría de flujo. La concentración plasmática de IL-7Rs se cuantificó por ensayo inmunoenzimático (RayBio®) y de IL-7 con MILLIPLEX MAP. Los datos obtenidos se analizaron según características clínicas demográficas, clasificación de gravedad por escalas pronósticas (PSI y CURB-65), y evolución de la NAC (ingreso a UCI, fallecimiento, entre otros). Los análisis estadísticos utilizados fueron chi cuadrado y prueba de Mann-Whitney (GraphPad Prism®), considerando significativa la diferencia si p<0,05. Resultados: La mediana de edad de los 202 adultos con NAC estudiados es 73 años (RIQ: 60-84 años); 100 son mujeres (49%) y 162 presentan comorbilidades (81%). Según PSI, 48 casos eran leves (24%), 44 moderados (22%) y 110 graves (54%). Según CURB-65, 77 paciente eran leves (38%), 57 moderados (28%) y 68 graves (34%). Respecto a la evolución de la NAC, 117 pacientes requirieron oxigenoterapia (58%), 45 ingresaron a UCI (22%) y 32 fallecieron (16%), siendo mayores las proporciones en adultos ≥65 años (p<0,05). En el SNP c.731 C>T, el alelo C y el genotipo CC fueron más frecuentes en pacientes graves que en leves según CURB-65 (p<0,05): el genotipo CT fue más frecuente en casos moderados que en leves y graves (p<0,02) y el genotipo TT fue más frecuente en los leves que moderados según PSI (p=0,02) y no se relacionó con la evolución de la NAC. En el SNP c.801-21 A>T, el genotipo AT fue más frecuente en casos moderados que en leves (p<0.001) y graves (p<0,02), mientras que el genotipo TT fue más frecuente en leves y graves que en moderados (p<0,01) según PSI; el alelo T y el genotipo TT fueron más frecuentes del SNP c.801-21 A>T fueron más frecuente en los enfermos que ingresaron a UCI que en los que no ingresaron (p<0,05). En el SNP c.1066 A>G, el genotipo GG fue más frecuente en pacientes graves que en leves según CURB-65 (p=0,03); el alelo G y los genotipos AG y GG fueron más frecuentes en quienes ingresaron a UCI que en los que no ingresaron (p<0,02); el genotipo AA fue más frecuente en quienes no ingresaron a UCI (p<0,001), y el genotipo GG fue más frecuente en los fallecidos (p<0,02). La expresión relativa del gen Il7r está disminuida en los pacientes clasificados como moderados (p=0,03) y graves (p<0,01) respecto a los leves según PSI; en fallecidos respecto a no fallecidos (p<0,02), y en pacientes con enfermedad pulmonar crónica obstructiva (EPOC) que en los que no tienen EPOC (p=0,002). El recuento de CD3+ y de CD3+CD127+ están disminuidos en adultos con NAC ≥65 años respecto a <65 años (p<0,03) y en los casos moderados y graves respecto a los leves según PSI (p<0,05). De acuerdo con CURB-65, solo hay disminución del recuento CD3+CD127+ en pacientes graves respecto a leves (p<0,03). La concentración plasmática de IL-7Rs está aumentada ≥65 años vs <65 años, en quienes tienen una evolución de la enfermedad <7 días vs ≥7 días, en los casos moderados y graves que leves según PSI, en pacientes graves que no graves según CURB-65 y en fallecidos respecto a sobrevivientes (p<0,02). El área bajo la curva para los niveles plasmáticos de IL-7Rs fue 0,71 (95% CI: 0,60-0,81) para la predicción de mortalidad dentro de los 30 días post alta. La concentración plasmática de IL-7 está disminuida en adultos con NAC bacteriano respecto a casos virales, en quienes recibieron oxigenoterapia vs los que no y en quienes ingresaron a UCI respecto a los no admitidos en UCI (p<0,03). Los genotipos CC (c.731 C>T), AA (c.801-21 A>T) y GG (c.1066 A>G) están asociados a mayor concentración plasmática de IL-7Rs. No se detectó asociación entre los SNPs y la concentración plasmática de IL-7. Conclusión: Los SNPs c.801-21 A>T y c.1066 A>G de Il7r podrían estar relacionados con la gravedad de la NAC, donde los genotipos TT y GG están asociados con peor pronóstico de la enfermedad. Este es el primer estudio que relaciona estos SNPs con la concentración plasmática de sIL-7Rα en adultos con NAC. El incremento en la concentración plasmática de sIL-7Rα podría ser un biomarcador temprano de riesgo de muerte en adultos con NAC

Introduction: Community-Acquired Pneumonia (CAP) is an acute lung inflammatory process triggered by bacteria and/or viruses acquired in the community medium with an important rate of morbidity and mortality. There are clinical severity scales, such as PSI or CURB-65, that predict the risk of mortality and provide orientation in the clinical management of the patient. Despite their usefulness, these scales have limitations, due to this, studies have focused on investigating biomarkers that allow forecasting the evolution of this illness, which depends more on the immune response of the host than on the infectious agent in adults. Prior studies on adults with CAP and without any known immunodeficiency have shown a decrease in the CD4+ T Lymphocyte (TL) count and the genetic expression of Il7r (alpha subunit of the interleukin-7 receptor, IL-7Rα) in patients severe respect to the mild cases. IL-7R is a crucial receptor in the evolution, survival, and proliferation of TL. Single nucleotide polymorphisms (SNPs: c.731C>T, c.801-21A>T, c.1066A>G) of this receptor are related to infectious and autoimmune diseases, through the generation of the soluble isoform of this receptor (sIL-7R), that regulates the signaling pathway of the axis IL-7/IL-7R. This pathway has not been studied for CAP. Objective: To evaluate if the allele and genotype frequency of the c.731 C>T, c.801-21 A>T and c.1066 A>G polymorphisms; the genetic expression of Il7r; the percentage of cells that express IL7R; the plasma concentration of soluble IL7R and the IL7 ligation; differ among adults with community-acquired pneumonia with different clinical evolution. Methodology: This study analyzed 202 cases of adults who were hospitalized with CAP in three hospitals in Santiago (Hospital Clínico de la Universidad de Chile, Hospital de Enfermedades Infecciosas Dr. Lucio Córdova and Complejo Hospitalario San José) between May 2017 and August 2019. The presence of S. pneumoniae and Legionella antigens in urine was investigated using Binax®, while the presence of the genome of atypical viruses and bacteria in respiratory samples was investigated using real-time polymerase chain reaction (qPCR) (Argene®). Analyses of IL-7R and its signaling axis were performed in samples of peripheral venous blood. The genotyping of the c.731 C>T and c.1066 A>G SNPs was carried out through qPCR with a high-resolution melt curve (HRM), while for c-801-21 A>T an allele-specific qPCR was used. The relative expression (fold change) of the gene Il7r in the RNA of blood samples was established through reverse transcription and qPCR. The TL counts (CD3+) and those that express IL7Rα (CD3+CD127+) were determined through flow cytometry. The plasma concentration of sIL-7R was quantified by immunoenzymatic assay (RayBio®) and IL-7 was quantified by MILLIPLEX MAP. The obtained data was analyzed according to clinical demographic characteristics, severity classification by prognostic scale (PSI and CURB-65), and the CAP evolution (ICU admission, death, among others). The statistical analyses used were the chi-square and the Mann-Whitney tests (GraphPad Prism®), considering the difference significant p<0.05. Results: The 202 adults with CAP studied have a median age of 73 years (IQR: 60-84 years); 100 are women (49%) and 162 present comorbidities (81%). According to PSI, 48 cases were mild (24%), 44 moderates (22%), and 110 severe (54%). According to CURB-65, 77 patients were mild cases (38%), 57 moderates (28%), and 68 severe (34%). Regarding the CAP evolution, 117 patients required oxygen therapy (58%), 45 were admitted to an ICU (22%), and 32 died (16%); these clinical characteristics were more frequent in adults ≥65 years (p<0.05). In c.731 C>T SNP, the allele C and the CC genotype were more frequent in severe patients than in mild ones according to CURB-65 (p<0.05), the CT genotype was more frequent in moderate cases than in mild or severe according to PSI (p<0.02), TT genotype was more frequent in mild patients than in moderate ones according to PSI (p=0.02) and no relation was found in the CAP evolution. In c-801-21 A>T SNP c.801-21, AT genotype was more frequent in moderate cases than in mild (p<0.001) and severe (p<0.02), while the TT genotype was more frequent in mild and severe cases with respect to moderate according to PSI (p<0.01); The T allele and TT genotype were more frequent in sick adults who were admitted to an ICU than to those who were not admitted (p<0.05). In the c.1066 A> SNP, GG genotype was more frequent in severe patients than in mild ones according to CURB-65 (p=0.03); the G allele and, AG and GG genotypes were more frequent in those who were admitted to an ICU than to those who were not admitted (p<0.02); the AA genotype was more frequent in those who were not admitted to an ICU (p<0.001), and the GG genotype was more frequent in who died (p<0.02). The relative expression of the Il7r gene is diminished in patients classified as moderate (p=0.03) and severe (p<0.01) with respect to mild ones according to PSI; in dead patients with respect to non-dead ones (p<0.02); in patients with chronic obstructive pulmonary disease (COPD) with respect to those who do not have COPD (p=0.002). The lymphocyte count of CD3+ as well as of CD3+CD127+ is diminished in adults ≥65 years with respect to <65 years (p<0.03), and in cases moderate and severe in comparison with mild cases according to PSI (p<0.05). In terms of CURB-65, there is a decrease in the count of CD3+CD127+ only in severe patients with respect to non-severe ones (p<0.03). The plasma concentration of sIL-7R is increased in ≥65 years vs <65 years, in those who have an illness evolution <7 days vs ≥7 days, in the moderate and severe cases than mild cases according to PSI, in severe patients than mild according to CURB-65 and in dead patients respect to survivors (p<0.02). The area under the curve for the plasma levels of sIL-7R was 0.71 (95% CI: 0.60-0.81) for the mortality prediction within 30 days after medical clearance. The plasma concentration of IL-7 is diminished in adults with bacterial CAP with respect to viral cases, in those who received oxygen therapy treatment vs those who didn´t and those who were admitted in an ICU respect those not admitted to ICU (p<0.03). The CC (c.731 C>T), AA (c.801-21 A>T), and GG (c.1066 A>G) genotypes are associated with a larger plasma concentration of sIL-7R. No association was found between these SNPs and the plasma concentration of IL-7. Conclusion: The SNPs c.801-21 A>T and c.1066 A>G of Il7r are related to the severity of CAP, where the genotypes TT and GG are associated with the worst prognosis for the disease. This is the first study that relates these SNPs with the plasma concentration of sIL-7Rα in adults with CAP. The increase in the plasma concentration of sIL-7Rα might be an early biomarker for the risk of death in adults with CAP