Dimorfismo sexual en el efecto de glucocorticoides sobre el patrón de expresión de microRNAs en el hipocampo de roedores

Abstract

Los glucocorticoides son hormonas esteroidales secretadas por las glándulas suprarrenales en un proceso dependiente de la actividad circadiana del eje hipotálamo-hipófisis-adrenal (HHA) o de un estímulo exógeno. Se sabe que los glucocorticoides, a través del receptor de glucocorticoides (GR) y de mineralocorticoides (MR), regulan una serie de procesos celulares y son cruciales para el desarrollo y la función del sujeto adulto al actuar como factores transcripcionales. El GR, además de regular la transcripción génica uniéndose a elementos de respuesta a glucocorticoides presentes en los promotores de los genes blanco, también puede regular la transcripción mediante transactivación, transrepresión o tethering a través de la interacción con otros factores de transcripción. Más aún, los glucocorticoides pueden modificar la expresión de genes mediante mecanismos epigenéticos al favorecer la desmetilación del DNA por la reducción en la expresión de metiltransferasas o regulando la expresión de RNAs no codificantes como los microRNAs (miRNAs). En el cerebro, el MR se expresa predominantemente en áreas límbicas como el hipocampo y el GR se expresa de forma ubicua, aunque se enriquece en el hipocampo y los núcleos paraventriculares del hipotálamo. El hipocampo es una estructura clave en procesos de aprendizaje y memoria y la evidencia indica que los glucocorticoides modifican la arborización dendrítica y la función neuronal. Por otra parte, la adrenalectomía, que suprime la síntesis de glucocorticoides, induce apoptosis en las neuronas granulares del giro dentado del hipocampo y además aumenta la proliferación de las células progenitoras, sugiriendo un doble rol: uno que inhibe la proliferación y otro que ejerce acciones tróficas propiciando la sobrevida de las células granulares. La activación del GR también inhibe la diferenciación celular en células progenitoras y por ende la neurogénesis. Aunque machos y hembras difieren ampliamente en cuanto a su fisiología y comportamiento, éstos comparten un genoma común, con la excepción de un número pequeño de genes en el cromosoma Y. Un posible mecanismo que explique el dimorfismo sexual a nivel fisiológico y patológico es la acción de miRNAs, los cuales surgen como un regulador importante del proceso de traducción, pudiendo interactuar con decenas de mRNAs blanco e impactar múltiples procesos biológicos y rutas metabólicas. Interesantemente, se ha descrito que los niveles de miRNAs en monocitos pueden ser influenciados por glucocorticoides, pero no existe información sobre hipocampo. Considerando los antecedentes expuestos, se propuso la siguiente hipótesis: “Corticosterona regula diferencialmente la expresión de miRNAs, influyendo diversos procesos celulares en el hipocampo de roedores macho y hembra”. Para evidenciar si la corticosterona, principal glucocorticoide de los roedores, regula diferencialmente la expresión de miRNAs en el hipocampo de roedores hembra y macho, se estudió su perfil de expresión en un modelo de ratas adrenalectomizadas (ADX) a las que se les administró corticosterona de forma sistémica. A su vez, para evaluar el posible rol del GR y MR en la regulación transcripcional de los miRNAs y los procesos celulares asociados, se realizó un análisis in silico de las regiones promotoras de los genes de miRNAs y se determinó la red de interacción de mRNAs blanco validados para los miRNAs expresados diferencialmente. Finalmente, para evaluar la participación directa del GR en la expresión de los miRNAs se estudió su perfil de expresión en un modelo de ratones knockout para el GR restringido al hipocampo y al cerebro completo. En el modelo ADX, la corticosterona indujo un perfil de expresión de miRNAs particular en el hipocampo de las ratas hembra y macho, con pocos miRNAs comunes a estos grupos. A su vez, el número de miRNAs sensibles a la administración de corticosterona fue mayor en el hipocampo de machos respecto a hembras e incluso, generó principalmente una disminución y un aumento en la expresión de miRNAs, respectivamente. Con la idea de buscar reguladores comunes para los miRNAs diferencialmente expresados se realizó un análisis de promotores in silico, cuyos resultados sugirieron que ni el GR ni el MR regularían de forma directa la expresión de los miRNAs, sino que sería a través de mecanismos indirectos como, por ejemplo, mediante la interacción con otros factores transcripcionales como NF-κB. Por otra parte, los análisis in silico de los blancos regulados por los miRNAs diferencialmente expresados indicaron que los procesos celulares influenciados por la corticosterona también presentan diferencias sexo dependientes, pero que se entrecruzarían, conduciendo a respuestas celulares similares sobre neurogénesis, proliferación y apoptosis. Respecto a esto, se identificaron dos miRNAs (miR-186 y miR-223 en ratas hembra y macho, respectivamente) con una alta conectividad y en cuyos blancos se identificaron diversos genes involucrados en vías de muerte celular, diferenciación y crecimiento. Finalmente, en el modelo knockout del GR a nivel hipocampal y cerebro completo, también se obtuvo un perfil de expresión de miRNAs particular para cada grupo y que además es sexo dependiente. Prácticamente no se encontraron miRNAs comunes entre el modelo knockout y ADX, a excepción del miR-26b, miR-488 (en hembras) y miR-143 (en machos), que cambian su expresión en ambos modelos. En conjunto, estos resultados indican que la corticosterona ejerce un efecto dependiente del sexo sobre la expresión de un sinnúmero de miRNAs y que por asociación impactaría de forma diferencial distintos procesos neuronales. La regulación de la corticosterona sobre la transcripción de miRNAs no ocurriría por acción directa del GR, sino que por mecanismos indirectos como transactivación o transrepresión mediante la interacción con otros factores transcripcionales. Por último, el knockout del GR a nivel hipocampal y cerebral también ejerce un efecto dependiente del sexo sobre el perfil de expresión de miRNAs, el cual es distinto al de la corticosterona, sugiriendo una participación indirecta del GR en la regulación transcripcional o el desarrollo de mecanismos compensatorios

Glucocorticoids are steroidal hormones secreted by the adrenal glands in a process dependent on the circadian activity of the hypothalamic-hypophysis-adrenal axis (HHA), or an exogenous stimulus. It is known that glucocorticoids act on glucocorticoid receptor (GR) and mineralocorticoid receptor (MR) to regulate a series of cellular processes and also acting as transcriptional factors that are crucial for the development and function of the adult individual. In addition to regulating gene transcription by binding to glucocorticoid response elements present in the promoters of target genes, the GR can also regulate transcription by transactivation, transrepression or tethering through interaction with other transcription factors. Moreover, glucocorticoids can modify the expression of genes through epigenetic mechanisms by favoring the demethylation of DNA through reduced methyltransferase expression, or regulating the expression of non-coding RNAs, such as microRNAs (miRNAs). In the brain, the MR is expressed predominantly in limbic areas, such as the hippocampus and the GR is expressed ubiquitously, although it is enriched in the hippocampus and the paraventricular nuclei of the hypothalamus. The hippocampus is a key structure in learning and memory processes and the evidence indicates that glucocorticoids modify dendritic arborization and neuronal function. On the other hand, adrenalectomy, which suppresses the synthesis of glucocorticoids, induces apoptosis in the granular neurons of the hippocampus dentate gyrus and also increases the proliferation of progenitor cells, suggesting a double role: one that inhibits proliferation, and another that exerts trophic actions by promoting the survival of granular cells. Activation of the GR also inhibits cell differentiation in progenitor cells and thereby, neurogenesis. Although males and females differ widely in their physiology and behavior, they share a common genome, except for a small number of genes on the Y chromosome. A possible mechanism that explains sexual dimorphism at the physiological and pathological level is the action of miRNAs, which emerge as important regulators of the translation process, being able to interact with dozens of target mRNAs and impact multiple biological processes and metabolic pathways. Interestingly, reports have described that miRNA levels in monocytes can be influenced by glucocorticoids, but there is no information about the hippocampus. Considering the aforementioned background, we proposed the following hypothesis: “Corticosterone differentially regulates the expression of miRNAs, influencing various cellular processes in the hippocampus of male and female rodents.”. To demonstrate whether corticosterone -the main glucocorticoid of rodents- differentially regulates miRNA expression in the hippocampus of female and male rodents, their expression profile was studied in a model of adrenalectomized rats (ADX), to which corticosterone was systemically administered. Moreover, to evaluate the possible role of GR and MR in the transcriptional regulation of miRNAs and the associated cellular processes, we performed in-silico analysis of the promoter regions of miRNA genes and determined the interaction network of validated mRNA targets for differentially expressed miRNAs. Finally, to evaluate the direct participation of the GR in the expression of the miRNAs, its expression profile was studied in a GR knockout mice model restricted to the hippocampus and the whole brain. In the ADX model, corticosterone induced a particular expression profile of miRNAs in the hippocampus of female and male rats, with few miRNAs common to these two groups. Furthermore, the number of miRNAs sensitive to the administration of corticosterone was higher in the hippocampus of males than in females, and even induces decreased and increased miRNA expression, respectively. With the idea of searching for common regulators of differentially expressed miRNAs, we performed an in-silico promoter analysis and results suggests that neither the GR nor the MR would directly regulate miRNA expression; instead, it would be through indirect mechanisms such as, through the interaction with other transcriptional factors, such as NF-κB. On the other hand, in-silico analysis of the targets regulated by the differentially expressed miRNAs indicated that the cellular processes influenced by corticosterone also present sex-dependent differences, but they would cross-link, leading to similar cellular responses on neurogenesis, proliferation and apoptosis. Regarding this, we identified two miRNAs: miR-186 and miR-223 in female and male rats, respectively, with high connectivity and several genes involved in cell death, differentiation and growth pathways were found in their targets. Finally, in the GR knockout model at both the hippocampal and full brain levels, a particular miRNA expression profile -also sex-dependent- was obtained for each group. We practically did not find common miRNAs between the knockout and ADX models, with exception of miR-26b and miR-488 (in females) and miR-143 (in males), which change their expression in both models. Taken together, these results indicate that corticosterone exerts a sex-dependent effect on the expression of a countless number of miRNAs and by association, would differentially impact different neuronal processes. Regulation of miRNA transcription by corticosterone would not occur by direct action of GR, but by indirect mechanisms, such as transactivation or transrepression, through the interaction with other transcriptional factors. Finally, GR knockout at the hippocampal and cerebral levels also exerts a sex-dependent effect on the miRNA expression profile, which is different from that of corticosterone, suggesting an indirect participation of the GR in the transcriptional regulation or the development of compensatory mechanisms