Efecto de TNF-α sobre la protección conferida por vesículas extracelulares pequeñas endoteliales frente a isquemia/reperfusión

Abstract

El infarto del miocardio es actualmente la mayor causa de muerte a nivel mundial, llegando al 15% del total de muertes cada año. A lo largo de las décadas, diversas metodologías de cardioprotección se han desarrollado para limitar el daño del miocardio inducido por isquemia/reperfusión (I/R). El endotelio es un componente esencial en múltiples estrategias protectoras en infarto, secretando factores que han demostrado reducir el daño por I/R. Por otra parte, las vesículas extracelulares pequeñas (SEVs), como los exosomas, son pequeñas vesículas de 50-200 nm producidas por diversos tipos celulares. Estas nano-vesículas transportan proteínas, miRNAs, RNAs y DNA de una célula a otra, siendo una forma de comunicación celular muy variada. Adicionalmente, las SEVs son potenciales nuevos agentes cardioprotectores. En este sentido, se ha observado que las SEVs producidas por células endoteliales reducen la muerte celular generada por I/R in vitro. Si bien las estrategias cardioprotectoras han producido resultados exitosos en el laboratorio, esta realidad no se ha logrado reproducir en ensayos clínicos. Esta desconexión entre la ciencia básica y la clínica puede ser atribuida a la presencia de otros factores, tales como comorbilidades, co-medicaciones y envejecimiento. En este contexto, una posible explicación a la actual brecha entre el laboratorio y la clínica tiene relación con la inflamación, la cual es un factor común en la mayoría de las enfermedades asociadas a patologías cardiovasculares. Por esta razón, se ha postulado que condiciones proinflamatorias podrían reducir la efectividad de diversas estrategias cardioprotectoras en pacientes con comorbilidades. El presente estudio propuso como hipótesis de trabajo que las SEVs aisladas de células endoteliales en un estado proinflamatorio (activación endotelial), promueven la generación de SEVs defectuosas, anulando así su efecto protector en I/R. Para evaluar esta hipótesis, los objetivos consideraron el tratamiento de células endoteliales HUVEC con TNF-α y evaluación de expresión de parámetros proinflamatorios VCAM1, ICAM1 y eNOS mediante Western blot. Luego, se aislaron de SEVs de células endoteliales tratadas con la citoquina proinflamatoria TNF-α (aSEVs) utilizando cromatografía de exclusión por tamaño. Para caracterizar estas nano-vesículas, se midió su tamaño y concentración mediante Nanoparticle Tracking Analysis, mientras que la expresión del marcador de superficie CD81 fue determinado mediante inmunoensayo y su visualización y morfología fue evaluada por microscopia electrónica. El efecto de estas SEVs fue evaluado en un modelo de cardiomiocitos de rata neonata sometidos a I/R in vitro y en un modelo de I/R global ex vivo en corazones aislados de ratones adultos. Los resultados mostraron que el tratamiento de células HUVEC con TNF-α generó un aumento en el contenido proteico de los marcadores proinflamatorios VCAM-1, ICAM-1 e IL-6, además de la disminución de los niveles de eNOS. La caracterización de SEVs muestra un tamaño asociado a exosomas entre 100 y 200 nanómetros, además de presentar el marcador de superficie CD81, evaluado mediante inmunoensayo. En el modelo de I/R in vitro, no se observaron diferencias en el porcentaje de LDH -un marcador de muerte celular- entre las células tratadas con SEVs controles y las tratadas con aSEVs. En un modelo de infarto ex vivo, tampoco se observaron diferencias significativas en el tamaño de infarto entre los controles de I/R y los corazones tratados con SEVs o aSEVs. Sin embargo, se obtuvo un aumento en la presión de perfusión en los corazones tratados con aSEVs, lo que sugiere daño del miocardio. Por lo tanto, esta investigación propone a la inflamación como un blanco terapéutico para poder restaurar la cardioprotección mediada por SEVs en un contexto patológico en el cual existan comorbilidades asociadas

Myocardial infarction is currently the leading cause of death worldwide, reaching 15% of all deaths each year. Over the decades, various cardioprotective methodologies have been developed to limit ischemia/reperfusion (I/R)-induced myocardial damage. The endothelium is an essential component in multiple protective strategies in infarction, secreting factors that have been shown to reduce I/R damage. On the other hand, small extracellular vesicles (SEVs), like exosomes, are small 50-200 nm vesicles produced by various cell types. These nano-vesicles transport proteins, miRNAs, RNAs and DNA from one cell to another, being a very varied form of cellular communication. Additionally, SEVs are potential new cardioprotective agents. In this sense, it has been observed that SEVs produced by endothelial cells reduce cell death generated by I/R in vitro. Although cardioprotective strategies have produced successful results in the laboratory, this reality has not been reproduced in clinical trials. This disconnection between basic and clinical science can be attributed to the presence of other factors, such as comorbidities, co-medications, and aging. In this context, an explanation for the current gap between the laboratory and the clinic is related to inflammation, which is a common factor in most diseases associated with cardiovascular pathologies. For this reason, it has been postulated that proinflammatory conditions could reduce the effectiveness of various cardioprotective strategies in patients with comorbidities. The present study proposed as a working hypothesis that SEVs isolated from endothelial cells in a proinflammatory state (endothelial activation), promote the generation of defective SEVs, thus nullifying their protective effect on I/R. To evaluate this hypothesis, the objectives considered the treatment of HUVEC endothelial cells with TNF-α and evaluation of the expression of proinflammatory parameters VCAM1, ICAM1 and eNOS by Western blot. Then, SEVs were isolated from endothelial cells and treated with the proinflammatory cytokine TNF-α (aSEVs), using size exclusion chromatography. To characterize these nanovesicles, their size and concentration were measured by Nanoparticle Tracking Analysis, while the expression of the surface marker CD81 was determined by immunoassay and the morphology and visualization was evaluated by electron microscopy. The effect of these SEVs was evaluated in an in vitro I/R neonatal rat cardiomyocyte model and in an ex vivo global I/R model in isolated adult mouse hearts. The results showed that the treatment of HUVEC cells with TNF-α generated an increase in the protein content of the proinflammatory markers VCAM-1, ICAM-1 and IL-6, in addition to a decrease in eNOS levels. The characterization of SEVs shows a size between 100 and 200 nanometers, in addition to presenting the surface marker CD81, evaluated by immunoassay. In the in vitro I/R model, no differences were observed in the percentage of LDH -a marker of cell death- between cells treated with control SEVs and those treated with aSEVs. In an ex vivo infarct model, no significant differences in infarct size were observed between I/R controls and hearts treated with SEVs or aSEVs. However, an increase in perfusion pressure was evidenced in hearts treated with aSEVs, suggesting myocardial damage. Therefore, this research proposes inflammation as a therapeutic target to restore cardioprotection mediated by SEVs in a pathological context in which there are associated comorbidities