El inhibidor de rock, fasudil y el antidepresivo sertralina comparten efectos a nivel morfológico y molecular en el hipocampo de rata

Abstract

La depresión es un trastorno psiquiátrico muy prevalente en Chile y el mundo. Sus bases moleculares son prácticamente desconocidas, por lo que los tratamientos farmacológicos no han logrado ser del todo efectivos. En la actualidad los antidepresivos disponibles ejercen sus efectos luego de una administración prolongada, muchas veces de semanas a meses. Esto sugiere que los aumentos en la neurotransmisión noradrenérgica y serotoninérgica mediada por los fármacos antidepresivos no estarían explicando por sí mismo la mejoría clínica. Se describe a la depresión usualmente como una patología asociada al estrés y existe bastante evidencia que posiciona al estrés como el factor no genético más importante en el inicio y desarrollo de esta patología. El estrés modifica la densidad y morfología dendrítica de las neuronas piramidales del hipocampo, disminuye la neurogénesis y la sobrevida neuronal, por lo que corresponde a un aspecto importante que logra emular parte de los cambios observados en cerebros de sujetos depresivos. En la teoría actual de la etiología de la depresión se propone que las vías transduccionales asociadas a sobrevida, como la vía ERK-CREB-BCL-2 cumplen un rol activo. Por otro lado, se encuentra extensamente reportado que el estrés crónico produce una reducción en la arborización neuronal y en la densidad de espinas dendríticas en el área CA1 del hipocampo, la cual es prevenida por gran parte de los antidepresivos actuales. Desde el punto de vista molecular, las GTPasas de la familia Rho son capaces de comandar la dinámica del citoesqueleto de actina, el que determina la forma y la estabilidad de las espinas dendríticas. La señalización de RHOA antagoniza la formación y mantención de espinas dendríticas a través de su efector ROCK (del inglés, Rho associated coiled coil kinase). Actualmente se encuentra aceptado que este tipo de plasticidad estructural involucra procesos de traducción localizada de mRNAs en las espinas dendríticas. Proceso que puede ser regulado mediante la participación de microRNAs (miRNAs), los que corresponden a pequeñas moléculas que son capaces de reprimir traduccionalmente a sus transcritos blancos regulando activamente importantes procesos como los de remodelamiento de espinas dendríticas y sobrevida celular, entre otros. Más aún, la depresión, el estrés y los antidepresivos han mostrado promover cambios en el patrón de expresión de los miRNAs. Fasudil corresponde a un potente inhibidor de ROCK que ha mostrado acciones tipo antidepresivas en pruebas conductuales que determinan la eficacia antidepresiva. Tomando en cuenta el rol que cumple Fasudil en la señalización de vías críticas del remodelamiento de espinas dendríticas y a sus acciones tipo antidepresivas determinadas en pruebas conductuales realizadas en nuestro laboratorio, se propuso que este fármaco, al igual que el antidepresivo Sertralina, es capaz de activar la vía de sobrevida ERK-CREB-BCL-2 y prevenir los efectos deletéreos del estrés sobre la densidad y morfología de espinas dendríticas hipocampales a través de cambios en los niveles de proteínas relacionadas a remodelamiento de espinas dendríticas. Los efectos mencionados estarían relacionados a cambios en los niveles de miRNAs que tienen como blancos a algunas de éstas proteínas, por lo que se planteó la siguiente hipótesis: “El inhibidor de ROCK Fasudil, al igual que el antidepresivo Sertralina, activa la vía de sobrevida ERK-CREB-BCL-2 y previene los efectos del estrés sobre la densidad de espinas dendríticas hipocampales, lo que se relaciona con el cambio en los niveles de proteínas y miRNAs asociados a remodelamiento de espinas dendríticas” Con el objetivo de confirmar esta hipótesis, ratas Sprague Dawley macho fueron sometidas a un protocolo de estrés crónico (14 días consecutivos) por restricción de movimiento y se les administró Fasudil o Sertralina de forma intraperitoneal previo al protocolo de estrés. Adicionalmente se les administraron los fármacos a animales sin estresar para determinar el efecto de estas moléculas en diferentes contextos fisiológicos. Un día posterior a la última sesión de estrés o de administración de fármacos, los animales fueron eutanasiados, se les disecó el hipocampo y se determinó la densidad de espinas dendríticas en el área CA1 del hipocampo, al igual que los niveles de proteínas, mRNAs y miRNAs de las vías transduccionales de sobrevida y remodelamiento de espinas dendríticas. Los resultados de esta tesis permitieron determinar que Fasudil activa la vía de sobrevida CREB-BCL-2 de forma independiente a ERK. Esta activación se observó solamente en un contexto de estrés, por lo que queda de manifiesto la importancia del estado fisiológico del animal en la regulación de cascadas transduccionales, y más aún la similitud de Fasudil con Sertralina desde este punto de vista molecular. Fasudil además fue capaz de prevenir la disminución en la densidad de espinas dendríticas promovida por el estrés en el área CA1 del hipocampo. Este efecto preventivo en la disminución de espinas dendríticas ejercido por Fasudil, refuerza la relación de los efectos de este fármaco con la prevención de conductas tipo depresivas y además sugiere la participación de ROCK, en la modificación de espinas dendríticas. Aún, cuando existió una similitud de ambos fármacos, en la prevención de la disminución de espinas dendríticas, se observó una diferencia en cuanto a su morfología. Los resultados mostraron que en el caso de Sertralina, las espinas inmaduras no explican la prevención del efecto del estrés por si solas, existiendo una tendencia que, si bien no es estadísticamente significativa, sugiere que este fármaco estaría aumentando además la cantidad de las espinas tipo callampa o maduras. Por otra parte, Fasudil ejerce su acción fundamentalmente en las espinas inmaduras, de forma similar a la acción que ejerce otro inhibidor de ROCK, como Y-27632 en cultivos primarios de neuronas hipocampales. Los resultados no mostraron diferencias significativas en los niveles de las proteínas asociadas a remodelamiento de espinas dendríticas evaluadas en homogeneizados de hipocampo. Sin embargo, los niveles de estas proteínas, que se relacionan con procesos de adhesión celular (NCAM, N-CADHERINA Y β-CATENINA) y a la señalización de GTPasas de la familia Rho (RHOA, APT-1 y LIMK) podrían estar variando específicamente en subpoblaciones localizadas en la espina dendrítica. Se evaluaron además los niveles de ciertos miRNAs cuyos blancos corresponden a proteínas asociadas a remodelamiento de espinas dendríticas. Se determinó que el estrés promovió un aumento en los niveles del miR-138, y que este aumento fue prevenido de forma parcial por Fasudil y total en caso de Sertralina. Si bien en este trabajo los niveles de miR-138 no se relacionaron a los de su blanco descrito APT-1, el análisis in silico de sus blancos potenciales y vías de señalización en las cuales podría estar implicado este miRNA, indicó una relación altamente probable con el remodelamiento de espinas dendríticas. A la luz de los resultados obtenidos en esta tesis, Fasudil, un fármaco cuyo mecanismo de acción dista bastante de los ejercidos por los antidepresivos conocidos, es capaz de producir acciones similares a Sertralina, tanto en un contexto morfológico, como molecular en el hipocampo. Estos efectos podrían ser atribuidos al cambio en los niveles de miRNAs implicados en el remodelamiento de espinas dendríticas, abriendo la posibilidad de explorar nuevos puntos de convergencia que sean capaces de explicar las acciones antidepresivas per se

Depression is a very prevalent psychiatric disorder in Chile and the world. Their molecular bases are practically unknown, so the pharmacological treatments have not been able to be completely effective. Currently available antidepressants exert their effects after prolonged administration, often from weeks to months. This suggests that increases in noradrenergic and serotonergic neurotransmission mediated by antidepressant drugs would not be self-explanatory of clinical improvement. Depression is usually described as a pathology associated to stress and there is enough evidence that positions stress as the most important non-genetic factor in the onset and development of this pathology. Stress modifies the dendritic density and morphology of pyramidal neurons of the hippocampus, decreases neurogenesis and neuronal survival, so it corresponds to an important aspect that manages to emulate part of the observed changes in brains of depressive subjects. In the current theory of the etiology of depression it is proposed that transductional pathways associated with survival, such as the ERK-CREB-BCL-2 pathway, play an active role. On the other hand, it is widely reported that chronic stress produces a reduction in neuronal arborization and density of dendritic spines in the hippocampus CA1 area, which is prevented by the current antidepressants. From the molecular point of view, GTPases of the Rho family are able to control the dynamics of the actin cytoskeleton, which determines the shape and stability of dendritic spines. RHOA signaling antagonizes the formation and maintenance of dendritic spines through its effector ROCK. It is currently accepted that this type of structural plasticity involves localized translation processes of mRNAs in the dendritic spines. This process can be regulated by the participation of microRNAs (miRNAs), which correspond to small molecules that are able to repress their white transcripts by actively regulating important processes such as dendritic spine remodeling and cell survival, among others. Moreover, depression, stress and antidepressants have been shown to promote changes in the expression pattern of miRNAs. Fasudil is a potent ROCK inhibitor that has shown antidepressant-like actions in behavioral tests that determine antidepressant efficacy. Considering the role played by Fasudil in the signaling of critical pathways of dendritic spine remodeling and its antidepressant-like actions determined in behavioral tests performed in our laboratory, it was proposed that this drug, like the antidepressant Sertraline, is able to activate The ERK-CREB-BCL-2 survival pathway and to prevent the deleterious effects of stress on the density and morphology of hippocampal dendritic spines through changes in the levels of proteins related to dendritic spine remodeling. The effects mentioned would be related to changes in the levels of miRNAs that target some of these proteins, so the following hypothesis was proposed: "The Fasudil ROCK inhibitor, like the antidepressant Sertraline, activates the ERK-CREB-BCL-2 survival pathway and prevents the effects of stress on the density of hippocampal dendritic spines, which is related to the change in levels of miRNAs and proteins associated with remodeling of dendritic spines " In order to confirm this hypothesis, male Sprague Dawley rats were subjected to a chronic stress protocol (14 consecutive days) by movement restriction and were administered Fasudil or Sertraline intraperitoneally prior to the stress protocol. In addition, the drugs were administered to animals without stress to determine the effect of these molecules in different physiological contexts. One day after the last stress or drug administration session, the animals were euthanized, the hippocampus was dissected and the density of dendritic spines was determined in the CA1 area of the hippocampus, as were the levels of proteins, mRNAs, and miRNAs of the transductional pathways for survival and remodeling of dendritic spines. The results of this thesis allowed to determine that Fasudil activates the survival pathway CREB-BCL-2 independently to ERK. This activation was only observed in a stress context, thus revealing the importance of the physiological state of the animal in the regulation of transductional pathways, and even more the similarity of Fasudil with Sertraline from this molecular point of view. Fasudil was also able to prevent the decrease in density of dendritic spines promoted by stress in the CA1 area of the hippocampus. This preventive effect in the reduction of dendritic spines exerted by Fasudil reinforces the relationship of the effects of this drug with the prevention of depressive type behaviors and also suggests the participation of ROCK in the modification of dendritic spines. Even when there was a similarity of both drugs, in the prevention of the decrease of dendritic spines, a difference in their morphology was observed. The results showed that in the case of Sertraline, immature spines do not explain the prevention of the effect of stress alone, although there is a tendency that, although not statistically significant, suggests that this drug would also increase the amount of the mushroom spines (mature spines). On the other hand, Fasudil exerts its action primarily on immature spines, similar to the action of another ROCK inhibitor, such as Y-27632 in primary cultures of hippocampal neurons. The results showed no significant differences in the levels of the proteins associated with remodeling of dendritic spines evaluated in hippocampal homogenates. However, the levels of these proteins, which are related to cell adhesion processes (NCAM, N-CADHERIN and β-CATENIN) and Rho GTPase signaling (RHOA, APT-1 and LIMK) may be specifically varying in subpopulations located in the dendritic spine. The levels of certain miRNAs whose targets correspond to proteins associated with remodeling of dendritic spines were also evaluated. It was determined that stress promoted an increase in miR-138 levels, and that this increase was partially prevented by Fasudil and totally in case of Sertraline. Although in this work the miR-138 levels were not related to those of its target APT-1 described, the in silico analysis of its potential targets and signaling pathways in which this miRNA might be involved indicated a highly probable relation with the remodeling of dendritic spines. In light of the results obtained in this thesis, Fasudil, a drug whose mechanism of action is quite different from that of known antidepressants, is capable of producing actions similar to Sertraline, both in a morphological and molecular context in the hippocampus. These effects could be attributed to the change in the levels of miRNAs involved in the remodeling of dendritic spines, opening the possibility of exploring new points of convergence that are able to explain the antidepressive actions per se