Efecto del estrés agudo por restricción de movimiento sobre el estado de fosforilación de FMRP y su asociación a las vías Pl3K-AKT-mTORc1 y MAPK ERK1/2 en hipocampo de rata

Abstract

El estrés corresponde a una respuesta fisiológica desencadenada ante una situación amenazante, promoviendo la adaptación y sobrevida. Esta respuesta es específica e involucra la activación de distintos circuitos neuronales y la liberación de mediadores neuroendocrinos. En el caso del estrés psicosocial se liberan principalmente catecolaminas y hormonas esteroidales (glucocorticoides), generando cambios en la transducción de señales (efectos rápidos) y en la expresión génica (efectos lentos) tanto a nivel central como periférico. El hipocampo es uno de los principales blancos de las hormonas del estrés debido a que participa en la retroalimentación negativa de la secreción de los glucocorticoides. Esta estructura es requerida principalmente para el aprendizaje asociativo, adquisición de memoria episódica, declarativa y espacial. Estudios morfológicos y bioquímicos han demostrado que las variaciones en los niveles de glucocorticoides secretados durante el ciclo circadiano y durante el estrés promueven modificaciones neuroplásticas en esta estructura, incluyendo cambios morfológicos, variaciones en la excitabilidad celular y en la eficacia sináptica, entre otras. Se ha descrito que el alza en la secreción de glucocorticoides inducido por un estrés agudo (episodio único) puede actuar como un modulador positivo o negativo de los procesos de memoria y aprendizaje relacionados al hipocampo. Entre los múltiples efectos del estrés, uno de los más importantes corresponde a los cambios neuroplásticos asociados a la morfología neuronal, en especial de aquellos relacionadas a la neurotransmisión glutamatérgica. Estos cambios además son asociados a procesos de aprendizaje y consolidación de la memoria, procesos que requieren de síntesis de novo de proteínas, involucrando transporte de ARNm hacia las dendritas y control de la traducción a nivel local. En relación a esto, la proteína de Retardo Mental Asociado al X Frágil (FMRP), que se encuentra principalmente en axones y dendritas, ejerce una actividad supresora de la traducción de transcritos que codifican para proteínas involucradas en actividad sináptica. La FMRP es fosforilada en la Ser499 por la quinasa de la proteína ribosomal S6 (S6K1), modificación que es necesaria para la represión traduccional asociada a polirribosomas estancados. En cultivos neuronales se ha descrito que receptores glutamatérgicos del tipo mGluR1/5 promueve la fosforilación de FMRP por medio de la S6K1 a través de la activación de las vías PI3K-AKT-mTORc1 y MAPK ERK1/2 con una temporalidad distinta. Por otra parte, se ha descrito que los glucocorticoides son capaces de inducir un aumento en la espinogénesis en dendritas a través de efectos rápidos que son mediados por la activación de diversas vías transduccionales, entre ellas la AKT, las MAPK ERK1/2, PKA y PKC. Estos efectos son inhibidos tanto por antagonistas del receptor de glucocorticoides, como por la actinomicina D (inhibidor de la traducción). En base a estos antecedentes, se propuso la siguiente hipótesis: “El estrés agudo por restricción de movimiento regula la fosforilación de la FMRP en hipocampo de rata, efecto que se correlaciona a la activación de las vías PI3K-AKT-mTORc1 y MAPK ERK1/2”. Ratas macho adultas fueron sometidas a 0,5 o 2,5 h de estrés de restricción de movimiento y fueron sacrificadas inmediatamente finalizado el estímulo. Otro grupo fue eutanasiado luego de 1,5; 6 y 24 h post estrés. La efectividad del estrés se comprobó por el incremento en el número de heces e incremento en el nivel de corticosterona observado por la aplicación de la restricción. A su vez, mediante qPCR se evaluó la respuesta de los genes de respuesta temprana c-Fos y Arc. Después de 0,5 h de estrés se observó un aumento en ambos ARNm. Por otra parte, usando Western blot se detectó un incremento modesto de la proteína ARC durante la sesión de estrés, alcanzando un máximo a las 1,5 h posterior a la restricción. Además, se determinó que el estrés por restricción de movimiento no cambia el estado de fosforilación de FMRP en Ser499 ni durante ni posterior a la respuesta de estrés. Sin embargo, se observa un aumento en los niveles de FMRP a las 0,5 h de iniciado el estímulo, hecho que es coincidente con la activación de la vía AKT-mTOR. Con respecto a las MAPK ERK1/2, su mayor nivel de fosforilación se detectó a las 6 h posterior al fin de la restricción, evento que sugiere la participación de respuestas lentas producidas por el estrés. Esta memoria demuestra por primera vez que durante el estrés agudo por restricción de movimiento se observa un aumento en los niveles de la proteína FMRP. Además el procedimiento de estrés promueve la activación de vías transduccionales relacionadas funcionalmente entre sí con un patrón temporal distinto. Queda claro que el estrés desencadena mecanismos que pueden regular procesos celulares críticos para la sobrevida neuronal, pero falta por evaluar la incidencia de estos cambios sobre el comportamiento animal

Stress is a physiological response triggered in a threaten situation, allowing adaptation and survival. This response is specific and involves the activation of numerous neural circuits and mediates the secretion of different neuroendocrine mediators. In the case of psychosocial stress, catecholamines and glucocorticoids are released, promoting changes on signal transduction pathways (fast effects) and in gene expression (slow effects) at a central and peripheral level. The hippocampus is one of the main targets of stress hormones because it is involved in the negative feed-back of glucocorticoid secretion. This structure is mainly required for associative learning and acquisition of episodic, declarative and spatial memory. Morphological and biochemical studies have shown that fluctuation of glucocorticoids levels, due to stress-induced secretion or circadian rhythm pulses, promotes neuroplastic changes including morphological changes, variations in cellular excitability and synaptic efficacy among others. It has been reported that an increase on glucocorticoid secretion induced by a single acute stress session may act as a positive or negative modulator of memory and learning processes related to hippocampus. Among of the multiple effects of stress, the most important is related to neuroplastic changes associated with neuronal morphology, especially those associated to glutamatergic neurotransmission. These changes are also linked to processes of learning and memory consolidation, being both dependent of de novo local protein synthesis, involving mRNA transport to dendrites and local control of translation process. In line with this, the Fragile X Mental Retardation Protein (FMRP), mainly found in axons and dendrites, acts suppressing translation of mRNAs encoding proteins involved in the regulation of synaptic activity. FMRP is phosphorylated by S6K1 at Ser499 (p-FMRP), a modification required for mRNA translational repression and its association with stalled polyribosomes. It has been described, in neuronal cultures, that mGluR1/5 type glutamatergic receptor promotes FMRP Ser499 phosphorylation by S6K1 trough PI3K-AKT-mTORc1 and MAPK ERK1/2 pathways activation in a different temporal pattern. Otherwise, glucocorticoids are able to induce an increase in dendritic spinogenesis through fast effects mediated by transduccional pathways involving the activation of AKT, MAPK ERK1/2, PKA and PKC. These are inhibited both by glucocorticoid receptor antagonist or Actinomycin D a translation inhibitor. Based on this evidence the following hypothesis was proposed: “Acute restraint stress regulates FMRP phosphorylation in rat hippocampus, effect correlated with the activation of PI3K-AKT-mTORc1 and MAPK ERK1/2 pathways”. Adult male rats were submitted to 0.5 or 2.5 hours of restraint stress session and then were euthanized immediately. In order to evaluate the long-term of stress on hippocampus, another group was sacrificed after 1.5; 6 and 24 hours post stress. The effectiveness of the stress model was proven by the increase in the number of feces during stress procedure and the rise in corticosterone levels by the restriction protocol. In order to evaluate changes in mRNAs of c-Fos and Arc early genes, RT-qPCR was carried out. After 0.5 h of restraint stress an increase in both mRNAs was observed. Using Western-blot analyses, we detect a modest increase in ARC level during the stress procedure, reaching a maximum 1.5 hours after the stress session. Taken altogether these results, we suggest the involvement of ionotropic glutamatergic receptors during the early stress response. It was determined that restraint stress did not change the phosphorylation levels of FMRP at Ser499, during and after the stress response. Nevertheless at 0.5 hours of stress session there was an increase in FMRP levels, which correlates with the AKT-mTORc1 pathway activation. In relation to MAPK ERK1/2 pathway, a peak level of phosphorylation was detected 6 h after restraint, result that suggests the involvement of slow responses produced by stress. For the first time, this thesis demonstrated that acute restraint stress promotes an increase in FMRP levels during stress, together with the activation of signal transduction pathways functionally related triggered by stress with a different temporal pattern. It is clear that stress triggers mechanisms that can regulate critical cellular processes for neuronal survival, but it remains to evaluate the impact of these changes on animal behavior