Angiotensina–(1-9) reduce la expresión de marcadores pro-inflamatorios inducidos por TNF-alfa en células endoteliales

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son las más prevalentes y mortales en Chile y el mundo. Dentro del sistema cardiovascular, el endotelio juega un papel clave en el desarrollo de múltiples ECV, generalmente a través de su papel como mediador de procesos inflamatorios. La expresión de proteínas proinflamatorias tales como VCAM-1, ICAM-1 y e-Selectina, al igual que la disminución de producción de óxido nítrico (NO) por la pérdida de funcionalidad de la eNOS, son factores claves en el desarrollo de ECV. Angiotensina-(1-9) [Ang-(1-9)], es un péptido que actúa mediante la activación del receptor AT2R y se ha postulado como un potencial agente terapéutico en ECV. La prevención del remodelado cardiaco y efectos antihipertensivos sugieren que este péptido podría ser un componente del Sistema Renina Angiotensina (SRA) contra-regulatorio, que actuaría en distintos tipos celulares. Sin embargo, se desconoce si ejerce efectos antiinflamatorios en el endotelio vascular. Por lo tanto, en esta tesis se propuso la siguiente hipótesis: Ang–(1-9) reduce la expresión de marcadores pro-inflamatorios en células endoteliales estimuladas con TNF-α a través del receptor AT2, disminuyendo la activación de la vía de NF-kB. Para probar esta hipótesis, células HUVECs fueron estimuladas con la citoquina pro-inflamatoria TNF-α para inducir un estado similar al inflamatorio encontrado en patologías cardiovasculares. Una vez incubadas con TNF-α, se evaluaron distintas concentraciones (0,01; 0,1; 1; 10 y 100 μM) y tiempos de co-incubación (3, 8 y 24 h) con Ang-(1-9) y se evaluó la expresión de los marcadores proinflamatorios VCAM-1, ICAM-1 y e-Selectina y del marcador de activación endotelial eNOS mediante Western blot. Además, se evaluó mediante ensayo de LDH, que los estímulos utilizados no generaban muerte celular. No se encontraron diferencias significativas en los porcentajes de muerte celular en ninguna de las concentraciones, ni en los tiempos evaluados (3 y 24 h). No se encontraron cambios en la expresión de los marcadores VCAM-1, ICAM-1 y eNOS, al ser comparados con el grupo control (HUVECs con TNF-α y sin Ang-(1-9), en ninguna de las concentraciones y tiempos evaluados (3, 8 y 24 h). Por otra parte, la co-incubación de TNF-α y Ang-(1-9) a 0,1; 1 y 10 μM por 3 h, generó un aumento en el contenido proteico de e-Selectina. En vista de los resultados, se evaluó la presencia del receptor AT2R por Western blot y se observó que el receptor no se expresa HUVECs. Este resultado explica la ausencia de efecto de Ang-(1-9), en directa contradicción de la literatura actual

Cardiovascular diseases (CVD) are the most prevalent and deadly in Chile and the world. Within the cardiovascular system, the endothelium plays a key role in the development of multiple CVDs, generally through its role as a mediator of inflammatory processes. The expression of proinflammatory proteins such as VCAM-1, ICAM-1 and e-Selectin, as well as the decrease in nitric oxide (NO) production due to the loss of eNOS functionality, are key factors in the development of CVD. Angiotensin-(1-9) [Ang-(1-9)], is a peptide that acts by activating the AT2R receptor and has been postulated as a potential therapeutic agent in CVD. The prevention of cardiac remodeling and antihypertensive effects suggest that this peptide could be a component of the counterregulatory Renin Angiotensin System (RAS), which would act on different cell types. However, it is unknown whether it exerts anti-inflammatory effects on the vascular endothelium. Therefore, in this thesis the following hypothesis was proposed: Ang–(1-9) reduces the expression of pro-inflammatory markers in endothelial cells stimulated with TNF-α through the AT2 receptor, decreasing the activation of the NF pathway -kB. To test this hypothesis, HUVECs were stimulated with the pro-inflammatory cytokine TNF-α to induce a state similar to the inflammatory state found in cardiovascular pathologies. Once incubated with TNF-α, different concentrations (0.01; 0.1; 1; 10 and 100 μM) and co-incubation times (3, 8 and 24 h) with Ang-(1-9) were evaluated. and the expression of the proinflammatory markers VCAM-1, ICAM-1 and e-Selectin and the endothelial activation marker eNOS was evaluated by Western blot. In addition, it was evaluated by LDH assay that the stimuli used did not generate cell death. No significant differences were found in the percentages of cell death in any of the concentrations, nor in the evaluated times (3 and 24 h). No changes were found in the expression of the markers VCAM-1, ICAM-1 and eNOS, when compared with the control group (HUVECs with TNF-α and without Ang-(1-9), at any of the concentrations and times evaluated (3, 8 and 24 h). On the other hand, the co-incubation of TNF-α and Ang-(1-9) at 0.1, 1 and 10 μM for 3 h, generated an increase in the protein content of e-Selectin. In view of the results, the presence of the AT2R receptor was evaluated by Western blot and it was observed that the receptor is not expressed in HUVECs. This result explains the lack of effect of Ang-(1-9), in direct contradiction of the current literature