Caracterización de ARN no codificantes de respuesta a cobre en Enterococcus faecalis

Abstract

El Cu es un micronutriente y potencial tóxico para las bacterias. En Enterococcus faecalis, los niveles de Cu intracelular están regulados por el operón cop, formado por tres genes: copY, copA y copZ. Adicionalmente, frente a la exposición al Cu, en esta bacteria se observa un cambio importante a nivel transcripcional global al parecer de la acción de factores de transcripción, sugiriendo la presencia de otros mecanismos regulatorios involucrados en la respuesta. Los ARN no codificantes (ARNnc) corresponden a una familia de moléculas de ARN reguladores. A la fecha, en E. faecalis se han predicho alrededor 230 ARNnc, la mayoría de ellos caracterizados en el marco de su efecto sobre la respuesta a estrés general. Ante esto, el presente trabajo se direccionó en identificar ARNnc inducidos en respuesta a Cu en E. faecalis. En primer lugar, para un total de 585 posibles ARNnc codificados en el genoma de la bacteria, se les identificaron mediante el software intaRNA 1804 posibles blancos regulatorios. Posteriormente, los blancos de interés se clasificaron y seleccionaron por dos aspectos: i) Homeostasis de Cu y Respuesta a Cu y ii) Conservación de los ARNnc en el orden Lactobacillales. En paralelo, con el objetivo de maximizar los blancos del primer criterio, se revisó toda la literatura existente a mayo del 2021, encontrando 14 nuevos participantes proteicos en homeostasis de Cu los cuales se rastrearon el proteoma de E. faecalis mediante BLASTp, logrando encontrar 4 nuevos posibles componentes en esta bacteria. Luego de aplicar los criterios de selección, se obtuvo como resultado una lista final compuesta de 4 ARNnc (1 cis y 3 trans) y 4 blancos transcripcionales. Posteriormente, se estudió posibles cambios de abundancia de estos elementos frente a una exposición no letal de Cu (0,5 mM de CuSO4 por 3 h) mediante qPCR. Como resultado se obtuvo que ARNnc_1959 y sRNA_069_5_UTR aumentan aproximadamente 8 y 4 veces respectivamente, su abundancia transcripcional en la condición suplementada con Cu en relación con la condición basal, expresión que se correlacionó de forma positiva con sus blancos regulados, sugiriendo una posible regulación positiva a nivel post transcripcional por parte de estos ARNnc. Por el contrario, el ARNnc_1490 disminuye su expresión a la mitad en respuesta a Cu con respecto a la condición basal, correlacionándose negativamente con la expresión de su gen blanco. En particular, el blanco para este último ARNnc corresponde al transcrito para el operón cop, lo cual posiciona a este elemento como un excelente candidato para futuras investigaciones relacionadas con la regulación transcripcional de la homeostasis de Cu en E. faecalis. Finalmente, los resultados de esta tesis nos permitieron identificar por primera vez un conjunto de ARNnc de respuesta a Cu en una especie bacteriana, abriendo un campo interesante de investigación em el campo de regulación transcripcional y metales

Copper is a micronutrient and potentially toxic to bacteria. In Enterococcus faecalis, intracellular copper levels are regulated by the cop operon, made up of three genes: copY, copA, and copZ. Additionally, when exposed to Cu, a significant change is observed in this bacterium at the global transcriptional level, apparently due to the action of transcription factors, suggesting the presence of other regulatory mechanisms involved in the response. Non-coding RNAs (NcRNAs) correspond to a family of regulatory RNA molecules. To date, around 230 NcRNAs have been predicted in E. faecalis, most of them characterized in the context of their effect on the response to general stress. Given this, the present work was aimed at identifying NcRNAs induced in response to Cu in E. faecalis. First, for a total of 585 possible NcRNAs encoded in the bacterial genome, 1,804 potential regulatory targets were identified using the IntaRNA software. Subsequently, the targets of interest were classified and selected by two aspects: i) Cu homeostasis and response to Cu and ii) Conservation of NcRNAs in the order Lactobacillales. In parallel, to maximize the targets of the first criterion, all the existing literature was reviewed as of May 2021, finding 14 new protein participants in copper homeostasis, which were traced to the E. faecalis proteome by BLASTp, managing to find 4 possible new components in this bacterium. After applying the selection criteria, a final list composed of 4 NcRNAs (1 cis and 3 trans) and 4 transcriptional targets was obtained. Subsequently, possible changes in the abundance of these elements were studied against a non-lethal Cu exposure (0.5 mM CuSO4 for 3 h) by means of qPCR. As a result, it was obtained that ncRNA_1959 and sRNA_069_5_UTR increased approximately 8 and 4 times, respectively, their transcriptional abundance in the Cu-supplemented condition in relation to the basal condition, an expression that positively correlated with their regulated targets, suggesting a possible positive regulation to post transcriptional level by these NcRNAs. On the contrary, the ncRNA_1490 decreases its expression by half in response to copper with respect to the basal condition, negatively correlating with the expression of its target gene. In particular, the target for this last ncRNA corresponds to the transcript for the cop operon, which positions this element as an excellent candidate for future research related to the transcriptional regulation of Cu homeostasis in E. faecalis. Finally, the results of this thesis allowed us to identify for the first time a set of NcRNAs in response to Cu in a bacterial species, opening an interesting field of research in the field of transcriptional regulation and metals