Efecto de exosomas aislados de células endoteliales tratadas con Interleuquina-10 en la expresión de marcadores pro-inflamatorios en células endoteliales senescentes humanas

Abstract

Antecedentes: El envejecimiento y la inflamación crónica de bajo grado son factores de riesgo para el desarrollo de enfermedades cardiovasculares. También se conoce que la inflamación vascular crónica promueve la disfunción endotelial y que durante el envejecimiento se acumulan células senescentes. Estas presentan cambios fenotípicos característicos que incluyen detención del ciclo celular, alteración de sus funciones, expresión y secreción de factores pro-inflamatorios. Los exosomas (vesículas extracelulares entre 30-150 nm), forman parte de un complejo sistema de comunicación intercelular y han surgido como potenciales agentes terapéuticos en enfermedades cardiovasculares. Su contenido y funcionalidad varía dependiendo del contexto fisiológico y del tipo celular que las generan. La interleuquina-10 (IL-10) es una citoquina con potentes efectos anti-inflamatorios. Sin embargo, se desconoce si la estimulación de las células endoteliales con IL-10 puede promover la producción de exosomas que atenúan el fenotipo pro-inflamatorio asociado a endotelio senescente. Hipótesis: Interleuquina-10 estimula la secreción de exosomas con propiedades anti-inflamatorias en células HUVEC y reduce la expresión de marcadores pro-inflamatorios en células HUVEC senescentes. Metodología: Células endoteliales humanas de vena de cordón umbilical (HUVEC) se replicaron hasta alcanzar un estado de senescencia. Para evaluar el establecimiento del fenotipo senescente y pro-inflamatorio, se realizó tinción de β-galactosidasa, medición del área y perímetro celular y se evaluó la expresión de p16, p21, VCAM-1, ICAM-1, E-selectina y eNOS por Western blot. La expresión de Interleuquina-6 (IL-6) y p65 se evaluaron por qRT-PCR. Para evaluar migración celular se realizó el ensayo de cierre de herida con células de músculo liso vascular (A7r5) tratadas con o sin TNF-α (10 ng/mL). Los exosomas de células endoteliales se aislaron mediante cromatografía de exclusión por tamaño. Los exosomas se caracterizaron utilizando microscopía electrónica, determinación de CD81 mediante ensayo de ELISA y medición de tamaño y concentración de partículas utilizando Nanoparticle Tracking Analysis. Resultados: La replicación continua indujo un fenotipo senescente, reflejado en un aumento en el área y perímetro celular, tinción de β-Galactosidasa, expresión de p16, p21 y reducción en el contenido proteico de eNOS y e-selectina. VCAM-1 e ICAM-1 no se expresaron en células senescentes, pero los niveles de mRNA de IL-6 y p65 se encontraron aumentados en comparación al control. La estimulación de células con IL-10 en concentraciones de 20 o 100 ng/mL por 24 h no redujo la expresión de marcadores pro-inflamatorios en células endoteliales senescentes. El pre-tratamiento con IL-10 durante 24 h no alteró la concentración, tamaño, morfología o expresión de CD81 en exosomas producidos por células endoteliales, en comparación al control. Asimismo, el tratamiento con 108 partículas/mL por 24 h de exosomas aislados de células tratadas con y sin IL-10 tampoco disminuyeron la expresión de marcadores pro-inflamatorios en células endoteliales senescentes. Sin embargo, el tratamiento con 108 partículas/mL aisladas de células tratadas con o sin IL-10 por 24 h redujeron la migración de células vasculares de músculo liso inducida por TNF-α. Conclusiones: El tratamiento por 24 h con 108 partículas/mL de exosomas, al igual que el tratamiento por 24 h con IL-10 en concentraciones de 20 o 100 ng/mL, no revierten la expresión de marcadores pro-inflamatorios en células endoteliales senescentes, pero reducen la migración de células vasculares de músculo liso inducida por TNF-α

Background: Aging and chronic low-grade inflammation are risk factors for developing cardiovascular diseases, given that chronic vascular inflammation promotes endothelial dysfunction. During aging, senescent cells accumulate, which present characteristic phenotypic changes that include cell cycle arrest, alteration of their functions, expression, and secretion of pro-inflammatory factors. Exosomes (extracellular vesicles between 30-150 nm) are part of a complex intercellular communication system and have emerged as potential therapeutic agents in cardiovascular diseases. Their content and functionality vary depending on the physiological context and the cell type that generates them. Interleukin-10 (IL-10) is a cytokine with potent anti-inflammatory effects. However, it is unknown whether stimulating endothelial cells with IL-10 can promote the production of exosomes that can attenuate the pro-inflammatory phenotype associated with senescent endothelium. Hypothesis: Interleukin-10 stimulates the secretion of exosomes with anti-inflammatory properties in HUVEC and reduces the expression of pro-inflammatory markers in senescent HUVEC. Methodology: Human umbilical cord vein endothelial cells (HUVEC) were replicated until reaching a state of senescence. To evaluate the establishment of the senescent and pro-inflammatory phenotype, β-Galactosidase staining, area, and perimeter measurement were performed, and the expression of p16, p21, VCAM-1, ICAM-1, e-selectin and eNOS was evaluated by Western blot. Interleukin-6 (IL-6) and p65 expression were evaluated by qRT-PCR. To assess cell migration, a wound healing assay was performed using vascular smooth muscle cells (A7r5) treated with or without TNF-α (10 ng/mL). Endothelial cell exosomes were isolated by size exclusion chromatography. Exosomes were characterized using electron microscopy, determination of CD81 by ELISA assay, and measurement of particle size and concentration using Nanoparticle Tracking Analysis. Results: Continuous replication induced a senescent phenotype, reflected in an increase in cell area and perimeter, β-Galactosidase staining, expression of p16, p21, and reduction in protein content of eNOS and e-Selectin. VCAM-1 and ICAM-1 were not expressed in senescent cells, but IL-6 and p65 mRNA levels were found to be increased compared to the control. Stimulating cells with IL-10 at concentrations between 20-100 ng/mL for 24 h did not reduce the expression of pro-inflammatory markers in senescent endothelial cells. Pretreatment with IL-10 for 24 h did not alter the concentration, size, morphology, or expression of CD81 in exosomes produced by endothelial cells, compared to the control. Likewise, treatment with 108 particles/mL for 24 h of exosomes isolated from cells treated with and without IL-10 also did not decrease the expression of pro-inflammatory markers in senescent endothelial cells. However, treatment with 108 8 particles/mL isolated from cells treated with or without IL-10 for 24 h reduced TNF-α-induced migration of vascular smooth muscle cells. Conclusions: Treatment for 24 h with 108 particles/mL of exosomes, as well as treatment for 24 h with IL-10 at concentrations of 20-100 ng/mL, do not reverse the expression of pro-inflammatory markers in senescent endothelial cells but reduce migration of vascular smooth muscle cells induced by TNF-α