Desarrollo de estrategias analíticas para la extracción y determinación de Sildenafilo y Tadalafilo en muestras de orina

Abstract

En esta investigación el objetivo principal fue desarrollar y validar estrategias analíticas para la determinación de Sildenafilo (SLD) y Tadalafilo (TAD) de forma individual por Espectrofluorimetría, mediante la extracción por sorción en disco rotatorio (RDSE) desde muestras de orina. En primera instancia, se estudió la capacidad extractante de diferentes fases sorbentes con los analitos propuestos, en solución estándar. Para ésto, se utilizó dos en formato polvo siendo octadecil (C-18) y Oasis-HLB (O-HLB). También dos de tipo lámina, siendo nylon y estireno-divinilbenceno (e-DVB). Como resultado, se obtuvo que C-18 y Oasis-HLB presentaron altas recuperaciones para SLD(84%), contrariamente para TAD, donde se logró extraer entre alrededor de un 30% con C-18 y un 59% con Oasis-HLB. Por otra parte, las láminas de e-DVB y Nylon generaron adición de interferencias durante la etapa de elución en etanol, provocado por el uso de cinta doble faz para adherirlas a los discos rotatorios. En concomitancia con las débiles características fluorescentes de los analitos, se favoreció la detección fluorescente directamente en la fase sorbente utilizando la técnica de iluminación frontal. Seleccionando la lámina de nylon para la extracción de TAD y para SLD se utilizó Oasis-MAX (O-MAX) una fase sorbente derivada de O-HLB, pero que adicionalmente presenta características de retención aniónica, fortaleciendo al retención de SLD en su forma desprotonada. De esta manera, se elimina el paso de elución de los analitos y se aumenta la sensibilidad de la medida sin la necesidad de derivatizar. Posteriormente, se optimizaron las variables químicas e hidrodinámicas involucradas en el proceso RDSE, evaluando la velocidad de rotación, tiempo de extracción, volumen de muestra y pH del medio extractante. Para la extracción de TAD con lamina de nylon se obtuvo un equilibrio estático agitando durante 90 min a 2000 rpm desde 15 mL de muestra en un intervalo de pH entre 6,5 - 7,5 y para SLD con O-MAX agitando durante 120 min a 2000 rpm desde 15 mL de muestra en un ambiente de NaOH 0,1M. Bajo estas condiciones, la extracción de SLD fue de 84% y 25% para TAD, individualmente. Se optimizó las variables espectrales involucradas en la detección fluorescente de los analitos, donde el uso de la técnica de iluminación frontal con respecto a la iluminación clásica mostró mejoras importantes en lo que respecta a sensibilidad, resolución espectral y eliminación de interferencias lumínicas. Así mismo, se evaluó las longitudes de onda y slitexc-em. De esta forma, se seleccionó la técnica de iluminación frontal para ambos casos, con ángulo de incidencia de 30° para SLD y 45° para TAD. La longitud de onda de excitación de SLD en O-MAX fue 380 nm y 250 nm para TAD en nylon, en ambos casos con una dimensión de slitexc-em 2,5-5,0 nm en conjunto con el voltaje del fotomultiplicador (PMT) a 400V y 700V para TAD y SLD, respectivamente. Bajo estas condiciones, la emisión fue cuantificada a 456 nm para SLD y 327 nm para TAD. Para la validación de los métodos, se utilizaron muestras de orina blanco enriquecidas de forma individual con cada analito y se desarrolló un protocolo para el tratamiento de las muestras previo al proceso de extracción, con la finalidad de eliminar las posibles interferencias de la matriz. Para muestras enriquecidas con SLD, se ajustó el pH con NaOH sólido, obteniendo valores sobre pH 12, por consecuencia se formó un precipitado blanquecino el cual fue descartado mediante centrifugación durante 15 min a 6000 rpm, el sobrenadante se agitó con carbón activado para eliminar la coloración propia de la matriz. Finalmente, la muestra se filtró al vacío y se utilizó la fase líquida para el proceso de extracción con O-MAX. Para muestras de orina enriquecidas con TAD, se ajustó pH con NaOH hasta obtener valores entre 6,5 y 7,5, de forma seguida se filtró al vacío para eliminar sólidos precipitados y se conservó la fase líquida para utilizarla en el proceso de extracción con lamina de nylon. Se evaluó la linealidad de los métodos en muestras de orina enriquecida con SLD 4,0 μg·mL-1 y TAD 2,0 μg·mL-1, individualmente, tomando diferentes alícuotas y realizando los procesos de extracción optimizados. Se determinaron los parámetros analíticos para cada método por espectrofluorimetría de iluminación frontal, resumidas en la Tabla I. Finalmente, se evaluó la precisión, exactitud y su categoría en la eco-escala analítica, obteniendo recuperaciones entre 98,7% y 103,2% con DER<4,1% para la determinación de SLD y para TAD se obtuvo recuperaciones entre 97,4% y 104% con DER<5,1%. Ambas metodologías están categorizadas como de excelente nivel verde, ya que no utilizan pasos de derivatización de analitos ni elución de solventes orgánicos y sumado a la minimización de residuos hacen que el método sea ecológico. Además, la propuesta es de bajo costo y fácil operación, particularmente en la simplicidad y automatización del proceso de extracción en comparación con otras estrategias

In this research, the main objective was to develop and validate analytical strategies for the determination of Sildenafil (SLD) and Tadalafil (TAD) individually by Spectrofluorimetry, through rotating disk sorptive extraction (RDSE) from urine samples. In the first instance, the extractability of different sorbent phases was studied with the proposed analytes, in standard solution. For this, two in powder format were used, being octadecyl (C-18) and Oasis-HLB (O-HLB). In addition two laminar sorbents were studied such as nylon and styrene-divinylbenzene (e-DVB). As a result, it was obtained that C-18 and Oasis-HLB presented high recoveries for SLD (> 75%), contrary to TAD, where it was possible to extract between around 30% with C-18 and 59% with Oasis-HLB . On the other hand, the e-DVB and Nylon sheets generated addition of interferences during the elution stage in ethanol, caused by the use of double-sided tape to adhere them to the rotating disks. In concomitance with the weak fluorescent characteristics of the analytes, the fluorescent detection directly in the sorbent phase was favored using the frontal illumination technique. Selecting the nylon sheet for the extraction of TAD and for SLD, Oasis-MAX (O-MAX) was used, a sorbent phase derived from O-HLB, but which additionally presents anionic retention characteristics, strengthening the retention of SLD in its deprotonated form. In this way, the elution step of the analytes is eliminated and the sensitivity of the measurement is increased without the need for derivatization. Subsequently, the chemical and hydrodynamic variables involved in the RDSE process were optimized, evaluating the rotation speed, extraction time, sample volume and pH of the extracting medium. For the extraction of TAD with nylon foil, a static equilibrium was obtained by stirring for 90 min at 2000 rpm from 15 mL of sample in a pH range between 6,5 - 7.5 and for SLD with O-MAX stirring for 120 min at 2000 rpm from 15 mL of sample in a 0.1M NaOH medium. Under these conditions, the extraction of SLD was 84% and 25% for TAD. The spectral variables involved in the fluorescent detection of the analytes were optimized, where the use of the frontal illumination technique with respect to the classical illumination showed important improvements regarding sensitivity, spectral resolution and elimination of light interferences. Likewise, the wavelengths and excitation-emission slits were evaluated. Thus, the frontal illumination technique was selected for both cases, with an angle of incidence of 30 ° for SLD and 45 ° for TAD. The excitation wavelength of SLD in O-MAX was 380 nm and 250 nm for TAD in nylon, in both cases with a dimension of slitexc-em 2.5-5.0 nm in conjunction with the voltage of the photomultiplier (PMT) at 400V and 700V for TAD and SLD, respectively. Under these conditions, the emission was quantified at 456 nm for SLD and 327 nm for TAD. For the validation of the methods, white urine samples enriched individually with each analyte were used and a protocol was developed for the treatment of the samples prior to the extraction process, to eliminate possible interferences from the matrix. For samples enriched with SLD, the pH was adjusted with solid NaOH, obtaining values above pH 12, consequently a whitish precipitate was formed which was discarded by centrifugation for 15 min at 6000 rpm, the supernatant was shaken with activated carbon to eliminate the own coloring of the sample. Finally, the sample was vacuum filtered and the liquid phase was used for the O-MAX extraction process. For urine samples enriched with TAD, pH was adjusted with solid NaOH to obtain values between 6.5 and 7.5, followed by vacuum filtration to remove precipitated solids and the liquid phase was preserved to be used in the extraction process with nylon sheet. The linearity of the methods was evaluated in urine samples enriched with SLD 4.0 μg·mL-1 and TAD 2.0 μg·mL-1, individually, taking different aliquots and performing the optimized extraction processes. The analytical parameters for each method were determined by forward illumination spectrofluorimetry, summarized in Table I. Finally, the precision, accuracy and its category in the analytical eco-scale were evaluated, obtaining recoveries between 98.7% and 103.2% with RSD <4.1% for the determination of SLD and for TAD recoveries were obtained between 97.4% and 104% with RSD <5.1%. Both methodologies are categorized as having an excellent green level, since they do not use analyte derivatization steps or elution of organic solvents and, added to the minimization of waste, make the method ecological. In addition, the proposal is low cost and easy to operate, particularly in the simplicity and automation of the extraction process compared to other strategies