Estudio del efecto antibacteriano de una nanoemulsión con curcumina y una nanocapsúla de quitosano sobre Helicobacter pylori

Abstract

El cáncer es una de las primeras causas de muerte a nivel mundial. Dentro de los tipos de cáncer, el gástrico es uno de los más agresivos y en Chile representa la segunda causa de muerte. Helicobacter pylori (H. pylori) es un microorganismo Gram negativo, considerado como uno de los principales factores de riesgo para el desarrollo de cáncer gástrico. La terapia triple usada contra este patógeno se ha vuelto parcialmente ineficiente, lo cual ha llevado a los investigadores a desarrollar nuevas estrategias para enfrentar la infección en humanos. La curcumina, molécula activa proveniente de la planta Cúrcuma longa, es una entidad química que ha sido intensamente investigada debido a sus propiedades terapéuticas, entre las que destacamos: anticancerígena, antiviral, antiinflamatoria, antioxidante y antimicrobiana. Sin embargo, la curcumina no es hidrosoluble, es inestable y posee baja biodisponibilidad. Debido a esto, se requiere de altas cantidades de curcumina para obtener efectos beneficiosos que, de igual manera, resultan ser poco reproducibles. Varias aproximaciones para enfrentar la baja hidrosolubilidad, inestabilidad y baja biodisponibilidad vienen desde el área de la Tecnología Farmacéutica; más concretamente, de la nanotecnología. En general, se busca contener la curcumina en nanosistemas para así mejorar las falencias mencionadas. En el Laboratorio de Drug Delivery y en el de Comunicaciones Celulares se ha desarrollado una nanoemulsión con curcumina que posee un importante efecto anticancerígeno. En este sentido, se hace interesante estudiar si esta formulación, o una versión mejorada de ésta, también posee un efecto al disminuir la carga bacteriana de H. pylori y así incidir positivamente en la prevención/tratamiento del cáncer gástrico. Para ello se evaluó 2 nanoformulaciones que contengan curcumina, una con carga superficial negativa "nanoemulsión" y la otra con carga positiva "nanocápsula de quitosano", y se analizó el potencial efecto que tendría sobre la viabilidad de H. pylori. De acuerdo con lo anteriormente descrito, se propone la siguiente hipótesis: "Las nanoemulsiones y nanocápsulas de quitosano que contienen curcumina inhibirán el crecimiento bacteriano de H. pylori 26695 y, disminuirán la infección de H. pylori 26695 sobre células gástricas GES-1". Los objetivos específicos propuestos son los siguientes: 1) Desarrollar y caracterizar nanoemulsiones y nanocápsulas de quitosano conteniendo curcumina. 2) Evaluar el efecto inhibitorio del crecimiento bacteriano de la nanoformulaciones en la cepa H. pylori 26695. . 3) Determinar si las nanoformulaciones pueden disminuir la infección de células gástricas GES-1 por H. pylori 26695. Las nanoformulaciones, desarrolladas mediante el método de desplazamiento de solvente, tienen un tamaño de alrededor de 200 nm para las nanoemulsiones y 300 nm para las nanocápsulas. Ambas formulaciones poseen un índice de polidispersión menor a 0,3 (lo que indica una población de nanoemulsiones y nanocápsulas bastante homogénea). Se realizaron ensayos de concentración mínima inhibitoria para determinar la concentración en la cual la curcumina contenida en las nanoformulaciones inhibe el crecimiento de H. pylori 26695. En el caso de la curcumina contenida en las nanoemulsiones, no se observó crecimiento bacteriano desde la concentración de 75 μM. En el caso de la curcumina contenida en la nanocápsula, no se observó crecimiento bacteriano desde la concentración de 50 μM. Adicionalmente, se analizó el efecto citotóxico de las nanoformulaciones sobre la línea celular gástrica GES-1. Para el caso de la curcumina contenida en la nanoemulsión se observó que a la mayor concentración evaluada (150μM) hay una disminución del 75% de viabilidad celular, sin embargo para la curcumina contenida en la nanocápsula a la mayor concentración evaluada (150μM) se observa una disminución del 20% de la viabilidad celular. Es importante destacar que los vehículos (nanosistemas sin curcumina) no fueron tóxicos en las células. Para analizar si la curcumina contenida en ambas formulaciones posee un efecto citotóxico en células GES-1, se decidió, en el caso de la curcumina contenida en la nanoemulsión, utilizar una concentración de 12,5 μM, la cual es la mínima concentración a la cual no se observa un efecto significativo sobre la viabilidad de las células GES-1, y en el caso de la nanocápsula se decidió utilizar la CMI. Con ambas concentraciones determinadas, se evaluó si la curcumina contenida en las formulaciones era capaz de disminuir la infección de células GES-1 con H. pylori cepa 26695. Los resultados observados dan cuenta de un porcentaje de internalización de alrededor del 10% cuando las células no son tratadas. Sin embargo, cuando la curcumina está contenida en las nanoemulsiones existe un porcentaje de internalización de 5% y cuando está contenida en las nanocápsulas es de 3%. Con respecto a la adherencia bacteriana existe una disminución del 30% de bacterias adheridas cuando las células GES-1 fueron tratadas con la curcumina contenida en la nanoemulsión. Para el caso del vehículo de la nanoemulsión, no se observan diferencias significativas con respecto al control. Para el caso de la curcumina contenida en la nanocápsula, se observó una disminución del 65% de bacterias adheridas a las células GES-1. Por su parte, el vehículo de la nanocápsula también disminuyó el porcentaje de bacteria adherida a las células GES-1 en un 30%. De acuerdo a los resultados mencionados, se puede concluir que tanto la nanoemulsión como la nanocápsula, son nanosistemas capaces de contener curcumina. Además, se demostró que son formulaciones estables. La curcumina contenida en la nanoemulsión y en la nanocápsula es capaz de disminuir completamente el crecimiento bacteriano de H. pylori cepa 26695 y también es capaz de disminuir la internalización de la bacteria a las células gástricas GES-1, cuando estas células son infectadas con H. pylori. Esto demuestra la capacidad de la curcumina para reducir el crecimiento bacteriano de H. pylori cepa 26695, y que puede ser potenciada al estar encapsulada en los nanovehículos seleccionados. A futuro, es imperativo analizar los mecanismos por los cuales la curcumina contenida en ambas formulaciones pueda tener este efecto en contra de H. pylori, pues hasta la fecha tales mecanismos no han sido dilucidados

Cancer is one of the leading causes of death worldwide. Among the types of cancer, gastric cancer is one of the most aggressive and in Chile represents the second cause of death. Helicobacter pylori (H. pylori) is a Gram-negative microorganism, considered one of the main risk factors for the development of gastric cancer. The triple therapy used against this pathogen has become partially inefficient, which has led researchers to develop new strategies to deal with infection in humans. Curcumin, an active molecule from the Turmeric longa plant, is a chemical entity that has been intensively investigated due to its therapeutic properties, among which we highlight: anticancer, antiviral, anti-inflammatory, antioxidant and antimicrobial activity. However, curcumin is not water-soluble, unstable and has low bioavailability. Because of this, high amounts of curcumin are required to obtain beneficial effects that, in the same way, turn out to be poorly reproducible. Several approaches to address low water solubility, instability and low bioavailability come from the area of Pharmaceutical Technology; more specifically, nanotechnology. In general, this approach seeks to solubilize curcumin in nanosystems in order to improve the aforementioned shortcomings. In the Drug Delivery Laboratory and in the Cellular Communications Laboratory, a nanoemulsión with curcumin was developed that has important anticancer effects. In this sense, it was interesting to determine whether this formulation, or an improved version of it, also served to reduce the bacterial load of H. pylori and thereby generate a strategy to prevent the development of gastric cancer. To do this, 2 nanoformulations containing curcumin were evaluated, one with a negative surface charge "nanoemulsión" and the other with a positive charge "chitosan nanocapsule", and the effects on the viablity of H. pylori were analyzed. In accordance with the above, the following hypothesis was proposed: “Nanoemulsions and Chitosan nanocapsules containing curcumin will inhibit the growth of H. pylori 26695 and decrease H. pylori 26695 infection of GES-1 gastric cells." The specific objectives proposed are the following: 1) To develop and characterize nanoemulsions and nanocapsules of chitosan containing curcumin. 2) To evaluate the inhibitory effect of nanoformulations on H. pylori 26695 growth. 3) To determine whether the nanoformulations can decrease the infection of GES-1 gastric cells by H. pylori 26695. We observed that the nanoformulations, developed using the solvent displacement method, have a size of around 200 nm for the nanoemulsions and 300 nm for the nanocapsules. Both formulations have a polydispersion index of less than 0,3 (indicating a fairly homogeneous population of nanoemulsions and nanocapsules). Minimum inhibitory concentration assays were performed to determine the concentration at which the curcumin contained in the nanoformulations inhibits the growth of H. pylori 26695. In the case of the curcumin contained in the nanoemulsions, no bacterial growth was observed at the concentration of 75 μM, while for nano-encapsulated curcumin bacterial growth was inhibited with concentrations of 50 μM. Additionally, the cytotoxic effect of nanoformulations on the gastric cell line GES-1 was analyzed. For curcumin contained in nanoemulsions, there was a 75% decrease in cell viability at the highest concentration evaluated (150μM); however for the nano-encapsulated curcumin viability decreased 20% at the highest concentration evaluated (150μM). Importantly, the vehicles (nanosystems without curcumin) were not toxic to cells. To analyze whether the curcumin contained in the two formulations was toxic to GES-1 cells, curcumin in the nanoemulsions was evaluated at a concentration of 12,5 μM, which is the minimum concentration at which no significant effect on the viability of GES-1 cells was observed. Alternatively, for the nano-encapsulated curcumin the minimal inhibitory concentration was employed. Using these concentrations, we determined whether the curcumin contained in the nanoformulations was able to reduce GES-1 infection by H. pylori 26695. The observed results account for an internalization percentage of about 10% when the cells are not treated. However, whith the nano-encapsulated curcumin there is an internalization percentage of 5% and when it is contained in the nanocapsules it is 3%. With regard to bacterial adherence there is a 30% decrease in bacteria adherence was detected. For the nanoemulsion vehicle alone, no significant changes in bacterial adhesion were observed with respect to the control. Alternatively, for nano-encapsulated curcumin, a 65% decrease in bacteria adhesion to GES-1 cells was observed. In this case, the nanocapsule vehicle alone also decreased the percentage of bacteria adhesion to GES-1 cells by 30%. According to our results, we may conclude that both the nanoemulsion and the nanocapsule represent nanosystems that serve as carriers for curcumin. In addition, they were shown to be stable formulations. The curcumin contained in nanoemulsions and in nanocapsules completely blocked the growth of H. pylori 26695 and also decreased adhesion of the bacterium to the gastric cells GES-1, when these cells were infected with H. pylori. This demonstrates the ability of curcumin to prevent the growth of H. pylori 26695 and that this property can be harnessed by solubilizing curcumin in the selected nanovehicles. In future studies, it will be important to identify the mechanisms by which curcumin contained in both formulations develops these effects against H. pylori, since to date such mechanisms have not been elucidated