Caracterización del complejo binario [SdiA/AHL] en la transcripción del operón ftsQAZ . ¿Una relación entre quorum sensing y división celular?

Abstract

El mecanismo de comunicación en bacterias se conoce como "Quorum Sensing" (QS). Mediante este mecanismo de comunicación celular se regulan procesos fundamentales de la fisiología bacteriana. En la bacteria Gram-negativa Escheichia coli se identificó una proteína homóloga a los reguladores transcripcionales de tipo R pero no se encontraron moléculas de acil homoserina lactonas (AHLs) en los cultivos. Este regulador transcripcional, denominado SdiA, se asoció a la transcripción del operón fsQAZ. Este transcrito da origen a las proteínas que forman parte de la maquinaria de división celular. Se postula que existe una relación entre QS y división celular, pero aún no se ha determinado el efecto que poseen las AHLs sobre la transcripción de estos genes y sobre el mecanismo de división celular. Se investigó el sistema de QS en E coli específicamente el efecto de la unión de AHL a la proteína SdiA con el objeto de definir el mecanismo de unión del ligando a la proteína y de esta al DNA de modo de explicar el porque no se observan efectos en la división de la bacteria. Se analizó el efecto de AHLs sobre la solubilidad de la proteína sobre-expresada. Se observó un aumento en la solubilidad de la proteína, pues incrementó la proteína en la fracción soluble. Para explicar como las AHLs influyen en la unión de SdiA a DNA, y determinar si la transcripción es mediada o facilitada por AHLs se caracterizó el efecto de AHL sobre la dimerización de la proteína. La inducción de un cambio conformacional asociado a la unión del

ligando y su posterior dimerización se evaluó midiendo la unión de AHL a la proteína SdiA, a través de apagamiento de fluorescencia. Los resultados muestran una afinidad en el rango nM, indicando que el apagamiento de la fluorescencia es debido a un cambio conformacional inducido por la unión de AHL que está probablemente asociado a la dimerización y a un cambio en el porcentaje de estructura secundaria. Por esta razón se evaluó el efecto de AHL sobre la estructura cuaternaria de la proteína y se determinó que la proteína en ausencia de AHL se encuentra principalmente como monómero y en presencia de AHL se inducen principalmente dímeros. Para identificar las regiones donde ocurre este cambio conformacional inducido por la dimerización en presencia del ligando, se hizo una cinética de intercambio isotópico. Se observó una significativa protección al intercambio tanto en el dominio N-terminal como en el dominio de unión a DNA. Se observó una alta afinidad de unión, en el rango nM, de la proteína a la secuencia promotora ftsQP2, resultado que se confirmó mediante la visualización del complejo proteína-DNA a través de microscopía de fuerza atómica. No hubo efecto de AHL sobre la unión de SdiA al DNA. Para evaluar el efecto del sistema descrito sobre la transcripción del operón trsQAZ se midió su expresión con el gen lacZ. Se observó un incremento en la transcripción cuando la proteína se sobre-expresaba en una cepa mutante para SdiA. Los resultados sugieren que la unión de AHL a SdiA induce la dimerización de SdiA, que como dímero activo se une a la región promotora ftsQP2 en el DNA