Caracterización del efecto de la acetilcolina sobre el desarrollo folicular de ovario de rata : origen de la inervación colinérgica, acción sobre receptores y de la necroptosis en la atresia folicular asociada con la función ovárica

Abstract

Es conocido que la secreción de esteroides y el desarrollo folicular del ovario de mamíferos es controlada por el hipotálamo a través de la secreción de la hormona liberadora de gonadotrofinas (GnRH), la que por vía portal, estimula la secreción de gonadotrofinas. Durante la última década, se ha obtenido evidencia experimental de que el sistema nervioso autonómico representa la regulación fina del funcionamiento ovárico. El sistema nervioso simpático a través de la norepinefrina (NE), es capaz de regular la secreción de esteroides y del desarrollo folicular. Aunque se sabe que el ovario recibe inervación parasimpática a través del nervio vago, solo existen evidencias aisladas sobre la función de la acetilcolina (ACh) en la secreción de esteroides y en el desarrollo folicular del ovario. Estudios previos de nuestro laboratorio mostraron que la administración intra-bursal de Huperzina A (bloqueador de la acetilcolinesterasa) durante 28 días, aumenta los niveles de ACh intra-ováricos favoreciendo el desarrollo folicular, demostrado por el aumento del número de folículos antrales sanos, cuerpos lúteos y una mayor fertilidad, pero aún no se sabe si la ACh regula el desarrollo folicular o modifica la atresia folicular ya que del balance de ambos procesos depende el número de folículos sanos que ovulan. El objetivo de este trabajo fue caracterizar bioquímica y funcionalmente el sistema colinérgico intra-ovárico y para ello planteamos la siguiente hipótesis: “La acetilcolina intra-ovárica estimula el desarrollo folicular de rata, regulando los procesos de atresia a través de necroptosis y regulando solo indirectamente la síntesis de esteroides foliculares”. Para ello, a.- estudiamos el origen de ACh intraovárica, b.- la distribución celular de los receptores muscarínicos (MR) del subtipo M1, M3 y M5, y c.- la participación de los MR en la esteroidogénesis del ovario. También estudiamos su participación en el desarrollo folicular ovárico de animales en condiciones normales y expuestos a condiciones de estrés en presencia o ausencia del antagonista muscarínico, atropina. Con respecto al primer punto encontramos que la denervación disminuyó la NE ovárica, pero no así la ACh ovárica, evidenciando una fuente local no neuronal de ACh. Con respecto al punto b.- los M1 están ubicados en células de la granulosa (GC) y especialmente en los folículos pre-antrales y antrales grandes. Los M5 están asociados con el sistema vascular ovárico y solo se encontraron rastros de M3. Finalmente, en el punto c.- la incubación de ovarios ex vivo mostró que el agonista de MR, Carbacol no modificó ni la producción de esteroides ni tampoco la expresión de las enzimas de su biosíntesis. Los estudios in vivo demostraron que el bloqueo de la acción colinérgica por la administración intra-bursal del antagonista atropina, in vivo durante 28 días, aumentó la atresia de los folículos secundarios. Los resultados apoyan la existencia de un sistema colinérgico intra-ovárico en el ovario de rata, localizado principalmente en las GC foliculares, que no está involucrado en la producción de esteroides sino más bien ejerce funciones tróficas como en la regulación de la atresia folicular. Dado que uno de los factores más afectados en el desarrollo folicular no solo fue la estimulación del desarrollo folicular, sino que importantemente la atresia folicular -- y debido a discrepancias en la literatura sobre la predominancia en los procesos de atresia folicular por apoptosis o necroptosis -- estudiamos la participación de la necroptosis como un mecanismo importante en la atresia folicular y sus modificaciones en procesos patológicos. La exposición crónica del ovario a la acción directa de inhibidores farmacológicos del paso clave en la cascada necroptótica: a. necrostatina-1 (NEC-1) y b. necrosulfonamida (NSA), para inhibir la necroptosis, produjo cambios importantes en el desarrollo folicular. La administración de NEC-1 durante 28 días, aumentó el número de folículos atrésicos pequeños y de estructuras pre-quísticas (folículos tipo III). Además, se observaron niveles elevados del marcador necroptótico la proteína Mlkl (mixed lineage kinase domain-like protein); sugiriendo que la inhibición de la cascada necroptótica a nivel de RPK1 sería uno de los mecanismos importantes que participan en la desaparición de los folículos atrésicos y en la transición de folículos tipo III a quistes. El tratamiento con NSA sin embargo, no cambió la morfología ovárica de los animales tratados, lo que sugiere un papel menor en la inhibición de la necroptosis a nivel de MLKL . El estrés simpático (caracterizado por un aumento de la atresia y el desarrollo de un fenotipo poli-quístico) aumentó la proteína Mlkl al igual que lo encontrado por inhibición con NEC-1, reforzando el papel in vivo de la necroptosis en la transición de folículos sanos a atrésicos en folículos antrales pequeños y en el cambio de pre-quistes a quistes, lo que sugiere que este proceso de muerte celular juega un papel importante en la fisiología ovárica y abre un nuevo blanco farmacológico para tratar patologías ováricas. En resumen, hemos obtenido importantes evidencias experimentales para comprender la participación de la ACh en la fisiología ovárica en condiciones normales y patológicas, abriendo estudios sobre la relevancia que tiene este sistema de neurotransmisor, hacia estudios farmacológicos para tratar la infertilidad de origen ovárico

It is known that the secretion of steroids and the follicular development of the mammalian ovary is controlled by the reproductive hypothalamus through the secretion of GnRH, which via the portal pathway stimulates the secretion of hypothalamic gonadotropins. During the last decade, experimental evidence has been obtained that the autonomic nervous system represents the fine regulation of ovarian function. The sympathetic nervous system, through norepinephrine (NE), regulates steroid secretion and follicular development. Although it is known that the ovary receives parasympathetic innervation via the vagus nerve, there is only isolated evidence on the role of acetylcholine (ACh) in steroid secretion and follicular development in the ovary. Previous studies in our laboratory showed that intrabursal administration of Huperzine A (acetylcholinesterase blocker) for 28 days increases intraovarian ACh levels, favoring follicular development, as demonstrated by the increased number of healthy antral follicles, corpora lutea and greater fertility. It is not yet known whether ACh regulates follicular development or modifies follicular atresia since the number of healthy follicles that ovulate depends on the balance of both processes. The objective of this work was to use biochemical and functional studies to characterize the intraovarian cholinergic system. We propose the following hypothesis: "Intraovarian acetylcholine stimulates rat follicular development, regulating atresia processes through necroptosis and regulating only indirectly the synthesis of steroids”. To do this, a.- we studied the origin of intraovarian ACh; b.- the cellular distribution of muscarinic receptors (MR) of the M1, M3 and M5 subtype; and c.- the participation of MR in ovarian steroidogenesis. We also studied their participation in the ovarian follicular development of animals under normal conditions or exposed to stress conditions in the presence or absence of the muscarinic antagonist, atropine. Regarding the first point, we found that denervation decreased ovarian NE, but not ovarian ACh, evidencing a non-neuronal local source of ACh. Regarding point b.- the M1 are located in the granulosa cells (GC) and especially in the large preantral and antral follicles. M5 are associated with the ovarian vascular system and only traces of M3 were found. Finally, at point c.- ex vivo incubation of ovaries showed that the MR agonist, Carbachol, did not modify either the production of steroids or the expression of biosynthetic enzymes. In vivo studies demonstrated that blockade of cholinergic action by intrabursal administration of the antagonist atropine, in vivo for 28 days, increased atresia of secondary follicles. The results support the existence of an intraovarian cholinergic system in the rat ovary, located mainly in the follicular GC, which is not involved in the production of steroids but rather exerts trophic functions and regulates follicular atresia. Given that one of the most affected factors in follicular development was not only the stimulation of follicular development but also, importantly, follicular atresia -- and due to discrepancies in the literature -- we studied the participation of necroptosis as an important mechanism in follicular atresia. follicular and its modifications in pathological processes. Chronic exposure of the ovary to the direct action of pharmacological inhibitors of the key step in the necroptotic cascade: a. necrostatin- 1 (NEC-1) and b. necrosulfonamide (NSA), to inhibit necroptosis, produced important changes in follicular development. The administration of NEC-1 for 28 days increased the number of small atretic follicles and precystic structures (type III follicles). In addition, elevated levels of the necroptotic marker protein Mlkl (mixed lineage kinase domain-like protein) were observed; suggesting that necroptosis would be one of the important factors in the disappearance of atretic follicles and in the transition from type III follicles to cysts. NSA treatment did not change the ovarian morphology of treated animals, suggesting a minor role in inhibiting necroptosis in rat ovaries. Sympathetic stress (characterized by increased atresia and the development of a polycystic phenotype) increased the Mlkl protein, reinforcing the in vivo role of necroptosis as the main process in the transition from healthy to atretic follicles in small antral follicles and in the change of precysts to cysts, suggesting a new pharmacological target to treat ovary-dependent pathologies