Efectos de navitoclax y resolvina D1 sobre la senescencia de fibroblastos cardiacos inducida por angiotensina II y LPS

Abstract

Las enfermedades cardiovasculares (ECV) se asocian fuertemente a procesos inflamatorios. Los fibroblastos cardiacos (FC) han demostrado tener un rol central en la respuesta inflamatoria cardiaca ante estímulos nocivos, actuando como célula centinela y secretando una serie de quimioquinas y citoquinas proinflamatorias. La senescencia celular se define como un arresto estable del ciclo celular y se caracteriza por la presencia de un fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP) que se compone en su mayoría de factores proinflamatorios y es capaz de mantener la inflamación y, además, perpetuar la senescencia actuando sobre células vecinas. En el último tiempo se ha propuesto a la senescencia celular como un factor importante en la progresión de enfermedades cardiacas. Diversos estudios han podido identificar que una acumulación aberrante de FC senescentes es responsable de la fibrosis cardiaca y el daño producido posterior a un infarto del miocardio. La senescencia del FC ha sido sujeto de estudio recientemente y se ha podido identificar diversos actores capaces de inducirla. Uno de ellos es la angiotensina II (Ang II), el principal péptido vasoactivo del eje renina-angiotensina-aldosterona. Se ha descrito que Ang II es capaz de inducir inflamación en el tejido cardiaco y existen reportes de que también es capaz de inducir senescencia de FC. Otra molécula que ha mostrado tener un efecto proinflamatorio importante sobre los fibroblastos cardiacos es el lipopolisacárido (LPS) y podría también tener un rol en la inducción de senescencia. Dada la importancia que está suponiendo la senescencia del FC en la fibrosis cardiaca, se vuelve fundamental encontrar herramientas que permitan contrarrestarla ya sea, eliminando células senescentes o evitando que más células se transformen en células senescentes. Dentro de las alternativas, Navitoclax ha emergido como una potencial alternativa terapéutica, ya que es capaz de erradicar células senescentes mediante la inducción de apoptosis celular. Dada la estrecha relación que existe entre la senescencia y la inflamación, otro enfoque que se está estudiando es revertir la senescencia actuando sobre el proceso inflamatorio. En este sentido, una alternativa de intervención es el uso de resolvina D1 (RvD1), un mediador especializado pro-resolutivo de la inflamación que ha demostrado tener un fuerte efecto antinflamatorio en FC. Este trabajo consta de dos objetivos. El primero es evaluar la inducción de senescencia de FC utilizando como estímulos la Ang II y el LPS. Además, se evalúa si la combinación de estos dos estímulos genera una inducción de senescencia mayor que cada uno por sí solo dado que comparten un mecanismo común de inducción de inflamación vía el inflamasoma NLRP3. El segundo objetivo es demostrar si navitoclax y RvD1 son capaces de atenuar la senescencia de los FC inducida por Ang II o LPS. Para evaluar la inducción de senescencia, los FC fueron tratados con Ang II, LPS o Ang II + LPS durante 24, 48 y 72 horas, luego, se determinó la expresión de proteínas asociadas a senescencia, la histona γH2AX, p21 y p53 mediante western blot, y se midió la actividad β-galactosidasa (SA-β-Gal). Para evaluar el efecto de navitoclax y RvD1, los FC fueron tratados con Ang II, LPS o Ang II + LPS por 24 horas, luego se realizó un lavado del medio de cultivo y se trató con navitoclax o RvD1 hasta alcanzar 72 horas de experimento. Posteriormente se evalúo la actividad SA-β-Gal. Se demostró que Ang II y LPS inducen senescencia en FC y, si bien la combinación de ambos estímulos induce senescencia, esta no es mayor a la inducida por cada estímulo por sí solo. Además, se demostró que navitoclax y RvD1 son capaces de revertir la senescencia de FC inducida por Ang II y LPS. Estos resultados demuestran que navitoclax, un fármaco senolítico y RvD1, un mediador especializado pro-resolutivo de la inflamación, son potenciales alternativas terapéuticas para revertir la senescencia de FC, la cual se asocia fuertemente a fibrosis cardiaca

Cardiovascular diseases are strongly associated with inflammatory processes. Cardiac fibroblasts have been shown to play a central role in the cardiac inflammatory response to noxious stimuli, acting as sentinel cells and secreting a series of proinflammatory chemokines and cytokines. Cellular senescence is defined as a stable cell cycle arrest and is characterized by the presence of a senescence-associated secretory phenotype (SASP) that is composed mostly of proinflammatory factors and is capable of maintaining inflammation and, in addition, perpetuate senescence by acting on neighboring cells. Recently, cellular senescence has been proposed as an important factor in the progression of heart disease. Several studies have been able to identify that an aberrant accumulation of senescent cardiac fibroblasts is responsible for cardiac fibrosis and the damage produced after a myocardial infarction. The senescence of cardiac fibroblasts has recently been subject of investigation, and various actors capable of inducing it have been identified. One of them is angiotensin II, the main vasoactive peptide of the renin-angiotensin-aldosterone axis. It has been described that angiotensin II is capable of inducing inflammation in cardiac tissue and some reports demostrate that it is also capable of inducing senescence of cardiac fibroblasts. Another molecule that has been shown to have an important proinflammatory effect on cardiac fibroblasts is LPS, and it could also play a role in senescence induction. Given the importance that cardiac fibroblast senescence has in cardiac fibrosis, it becomes essential to find tools that allow to counteract it, either by eliminating senescent cells or by preventing more cells from becoming senescent cells. Navitoclax has emerged as a potential therapeutic alternative, since it is capable of eradicating senescent cells by inducing cell apoptosis. Given the close relationship between senescence and inflammation, another approach currently being studied is to reverse senescence by acting on the inflammatory process. In this regard, an alternative intervention is the use of resolvin D1, a specialized pro-resolving mediator of inflammation that has been shown to have a strong anti-inflammatory effect on cardiac fibroblasts. This work has two objectives. The first is to evaluate the induction of senescence in cardiac fibroblasts using angiotensin II and LPS as stimuli and evaluate if the combination of these two stimuli generates a greater induction of senescence than each one by itself, given that they share a common mechanism of inflammation induction via the NLRP3 inflammasome. The second objective is to demonstrate whether navitoclax and resolvin D1 are capable of attenuating the senescence of cardiac fibroblasts induced by angiotensin II and/or LPS. To evaluate the induction of senescence, CFs were treated with angiotensin II, LPS or both for 24, 48 and 72 hours, then the expression of senescence-associated proteins, histone γH2AX, p21 and p53 and β-galactosidase activity was determined. To evaluate the effect of navitoclax and resolvin D1, CFs were treated with angiotensin II, LPS or both for 24 hours and treated with navitoclax or resolvin D1 until reaching 72 hours. Subsequently, β-galactosidase activity was evaluated. Results shown that angiotensin II and LPS are capable of inducing senescence in cardiac fibroblasts and the effect of the combination is not greater than that of each stimulus on its own. Furthermore, it was shown that navitoclax and resolvin D1 are capable of reversing senescence of cardiac fibroblasts induced by angiotensin II and LPS. These results demonstrate that navitoclax, a senolytic drug, and resolvin D1, a specialized pro-resolving mediator of inflammation, are potential therapeutic alternatives to reverse cardiac fibroblast senescence, which is strongly associated with cardiac fibrosis