Identificación de ARN no codificantes relacionados a sistemas de homeostasis de hierro en Enterococcus faecalis

Abstract

Enterococcus faecalis es una bacteria Gram positiva, anaerobia facultativa que forma parte de la microbiota intestinal. Desde hace unas décadas, se ha presentado como uno de los principales causantes de enfermedades nosocomiales, infecciones urinarias, bacteriemia y endocarditis. Al ingresar al organismo, esta bacteria debe superar las condiciones ambientales propias del cuerpo humano como la “inmunidad nutricional”, la cual consiste en limitar la mayor cantidad de nutrientes disponibles en el intestino, entre ellos el hierro. Este metal es fundamental para la supervivencia de las bacterias, puesto que existe una gran cantidad de proteínas que utilizan hierro como cofactor para catalizar una serie de procesos de óxido-reducción. A pesar de su importancia, la concentración de hierro intracelular está finamente regulada, ya que el exceso de este metal puede inducir daños mediados por la generación de radicales libres mientras que el déficit provoca la muerte de la bacteria. Dado esta dualidad que presenta el hierro, E. faecalis cuenta con una serie de mecanismos moleculares capaces de mantener una cantidad no letal dentro de su citoplasma, proceso denominado “homeostasis de hierro”. Uno de sus componentes más importantes es la proteína Fur, regulador maestro de la cantidad de hierro que, en condiciones de exceso del metal, reprime la expresión de genes que codifican para sistemas de captación de hierro a través de la unión a las cajas Fur. Por el contrario, bajo un escenario de déficit de Fe, se libera de la región promotora permitiendo que estos genes se expresen. En otras bacterias, además se ha descrito que Fur posee una actividad regulatoria indirecta, puesto también puede regular la expresión de ARN no codificantes (ARNnc), los cuales, a su vez, pueden regular mecanismos de homeostasis de hierro entre otros procesos. Si bien, existe un número importante de ARNnc descritos en E. faecalis, a la fecha no hay evidencia que estas moléculas participen en la regulación de componentes involucrados en la homeostasis de hierro en esta bacteria. Por ende, con los antecedentes expuestos se propuso la siguiente hipótesis: En la homeostasis de hierro en Enterococcus faecalis participan ARN no codificantes, cuya abundancia es controlada por el regulador Fur. Para verificar si nuestra hipótesis es verdadera, propusimos el siguiente diseño experimental: 1) Actualizar el modelo de homeostasis de Fe a través de una revisión bibliografía y posterior búsqueda de estos elementos en el proteoma de E. faecalis. Luego, a partir de un universo de 585 ARNnc identificados en E. faecalis y en conjunto con la herramienta bioinformática IntaRNA buscamos blancos de estos ARNnc entre los elementos del nuevo modelo de homeostasis de Fe. Finalmente, realizamos un análisis de conservación de los ARNnc seleccionados en el orden Lactobacillales. 2) Verificar si estos ARNnc seleccionados son capaces de responder transcripcionalmente a distintas disponibilidades de Fe en E. faecalis cepa silvestre. 3) Utilizando E. faecalis mutante Fur, comprobar si este factor de transcripción participa en la regulación transcripcional de estos ARNnc de forma directa o indirecta. Como resultado, logramos actualizar el modelo de homeostasis de Fe de E. faecalis aumentando en un 36% la cantidad de componentes. Por otro lado, la búsqueda de ARNnc que estuvieran regulando la expresión de los genes que codifican para estos componentes del nuevo modelo de homeostasis de E. faecalis resultó en 4 ARNnc (3 reguladores del ARNm que codifica para feoB y 1 regulador del ARNm de la hemolisina). Constatamos que la conservación de estos ARNnc seleccionados se dio en 3 de los 4 ARNnc y en especies cercanas a E. faecalis en el orden Lactobacillales ratificando el sesgo filogenético en la conservación de estos elementos. La cuantificación de los ARNnc seleccionados en las distintas disponibilidades de Fe reveló que éstos son capaces de responder transcripcionalmente al metal, lo que sugirió que debe existir un factor de transcripción que module esta actividad y que, a su vez, responda a Fe, como por ejemplo Fur. La cuantificación de los ARNnc seleccionados en E. faecalis Δfur en condiciones basales reveló un cambio de abundancia de estos elementos, lo que sugiere que Fur podría estar participar en la regulación de estos elementos. Sin embargo, la ausencia de cajas Fur en los promotores de los genes que codifican ARNnc sugiere que la regulación es de tipo indirecta y que los ARNnc están respondiendo a un efecto secundario como cambios en la concentración intracelular de Fe o a través de un segundo factor de transcripción. Siendo el Fe un micronutriente esencial para E. faecalis, profundizar en el estudio de nuevos ARNnc involucrados en el control de la homeostasis del metal en este patógeno oportunista es fundamental para el desarrollo de nuevas estrategias de control, como la generación de nuevos antimicrobianos

Enterococcus faecalis is a gram-positive, facultative anaerobic bacterium that is part of the intestinal microbiota. In recent decades, it has emerged as one of the main causes of nosocomial diseases, urinary tract infections, bacteremia and endocarditis. Upon entering the organism, this bacterium must overcome the environmental conditions inherent to the human body, such as "nutritional immunity", which consists of limiting the greatest amount of nutrients available in the intestine, including iron. This metal is essential for the survival of bacteria, since there are a large number of proteins that use iron as a cofactor to catalyze a series of oxidation-reduction processes. Despite its importance, the intracellular iron concentration is highly regulated, since an excess of this metal can induce damage mediated by the generation of free radicals, while a deficit causes the death of the bacteria. Given this duality of iron, E. faecalis has a series of molecular mechanisms capable of maintaining a non-lethal amount within its cytoplasm, a process called “iron homeostasis”. One of its most important components is the Fur protein, a master regulator of the amount of iron that, under conditions of iron excess, represses genes that code iron uptake systems through binding to Fur boxes. Conversely, under an iron deficit scenario, it is released from the promoter region allowing these systems to be expressed. In other bacteria, it has also been described that Fur has an indirect regulatory activity, since it can also regulate the expression of genes that code non-coding RNA (ncRNA), which, in turn, can regulate mechanisms of iron homeostasis among other processes. Although there is a significant number of ncRNAs described in E. faecalis, to date, there is no evidence that these molecules participate in the regulation of components involved in iron homeostasis in this bacterium. Therefore, with the exposed antecedents, the following hypothesis was proposed: Non-coding RNAs are involved in iron homeostasis in Enterococcus faecalis, which abundance is controlled by the Fur regulator. To verify whether our hypothesis is true, we proposed the following experimental design: 1) Update the Fe homeostasis model through a literature review and subsequent search for these elements in the E. faecalis proteome. Then, from a set of 585 ncRNAs using the IntaRNA bioinformatics tool, we searched for targets of these ncRNAs among the elements of the new homeostasis model. Finally, we performed a conservation analysis of selected ncRNAs in the order Lactobacillales. 2) Verify if these selected ncRNAs are capable of responding transcriptionally to different Fe availability in E. faecalis. 3) Using E. faecalis mutant strain for the Fur regulator, verify if this transcription factor is directly or indirectly involved in the transcriptional regulation of these ncRNAs. As results, we managed to update the Fe homeostasis model of E. faecalis by increasing the number of components by 36%. On the other hand, the search for ncRNAs that were regulating genes that code these components of the new E. faecalis homeostasis model resulted in 4 ncRNAs (3 regulators of the FeoB transporter and 1 regulator of hemolysin). We found that the conservation of these selected ncRNAs occurred in 3 of the 4 ncRNAs and in species close to E. faecalis in the order Lactobacillales, confirming the phylogenetic bias in the conservation of these elements. The quantification of the selected ncRNAs in the different Fe availabilities revealed that they are capable of responding transcriptionally to the metal, which suggested that there must be a transcription factor that modulates this activity and that, in turn, responds to Fe, such as Fur example. The quantification of the selected ncRNAs in E. faecalis Δfur under basal conditions revealed a change in the abundance of these elements, which is indicative that Fur could be involved in the regulation of these elements. However, the absence of Fur boxes in the promoters of the genes that code ncRNAs suggests that the regulation is of an indirect type and that the ncRNAs are responding to a secondary effect such as changes in the intracellular concentration of Fe and through a second transcription factor. Since Fe is an essential micronutrient for E. faecalis, deepening the study of new ncRNAs involved in the control of metal homeostasis in this opportunistic pathogen is essential for the development of new control strategies, such as the generation of new antimicrobials