Resolvina D1 y navitoclax disminuyen el número de miofibroblastos cardiacos senescentes inducidos por TGF-β1

Abstract

La búsqueda de nuevas terapias relacionadas a las enfermedades cardiovasculares ha cobrado gran relevancia dadas las alarmantes cifras respecto al porcentaje en el padecimiento de estas afecciones a nivel mundial. El fibroblasto cardiaco (FC) cumple un rol fundamental en esta materia, más aún cuando la literatura indica al perfil senescente y fibrótico en esta célula como responsable del deterioro en el funcionamiento del corazón. Existe evidencia que hay una estrecha relación entre la presencia de una población de miofibroblastos cardiaco (MFC) senescentes con infartos al miocardio, insuficiencia cardiaca, entre otros. La senescencia se define como el arresto irreversible del ciclo celular junto con un característico perfil secretor asociado a senescencia, más conocido como SASP. El TGF-β1 es una conocida citoquina proinflamatoria, profibrótica y prosenescente que los FC secretan de manera autocrina produciendo un cambio en su fenotipo, orquestando la transformación de un FC a MFC, que se caracteriza por el aumento en la expresión de α-SMA y el posterior ensamblaje de este formando fibras de estrés. Se ha descrito en la literatura la persistencia del fenotipo senescente presentando una marcada resistencia a la apoptosis Nuevas terapias farmacológica cuyo blanco son las células senescentes han emergido en los últimos años, y estos son los llamados fármacos “senoterapéuticos”. Estos fármacos se clasifican según su efecto, en donde los senolíticos inducen selectivamente la apoptosis de las células senescentes, mientras que los senomórficos o senostáticos modulan componentes del SASP sin inducir apoptosis. En el presente trabajo se propuso estudiar el efecto de los fármacos navitoclax y Resolvina D1 (RvD1). De lo expuesto anteriormente es que en esta tesis se propuso la siguiente hipótesis: Resolvina y Navitoclax disminuyen la senescencia de FC de rata inducidos por TGF-β1. Los objetivos fueron: a) establecer un modelo de senescencia de los MFC inducida por TGF-β1, y en paralelo la diferenciación de FC a MFC. b) el segundo objetivo fue evaluar el efecto se los fármacos senoterapéuticos en los MFC senescentes de rata. Para cumplir con el propósito de este trabajo se midió la actividad β-galactosidasa asociada a senescencia (SA-β-gal), en FC tratados con TGF-β1, los cuales posteriormente fueron tratados con navitoclax y RvD1. Las metodologías usadas fueron Western Blot, ensayos de actividad SA-β-gal, citoquímica con cristal violeta e inmunocitoquímica para α-SMA. Los principales resultados fueron que el tratamiento de FC de ratas neonatas con TGF-β1 indujo la diferenciación de FC a MFC de forma paralela a la senescencia de los MFC. Este resultado no fue estadísticamente significativo en FC de ratas adultas cultivadas en DMEM-F12, DMEM-F12 + SFB1% y DMEM-F12 + SFB1% + SB-431542. En los MFC senescentes de ratas neonatas se observó un aumento en p21 y una disminución en la fosforilación de Rb. El tratamiento con navitoclax y RvD1, disminuyó la actividad SA-β-gal, los niveles de p21 y no revirtió la disminución en la fosforilación de Rb. Del mismo modo, TGF-β1 aumentó los niveles de Bcl-XL y disminuyó los niveles de Bax, y no disminuyó los niveles de procaspasa 3, indicando que los MFC senescentes son resistentes a la apoptosis. Navitoclax y RvD1 revirtieron los efectos de TGF-β1. En conclusión, TGF-β1 induce senescencia de los MFC de ratas neonatas los cuales presentan resistencia a la apoptosis. Navitoclax y RvD1 mostraron efectos senolíticos

The search for new therapies related to cardiovascular diseases has gained great relevance given the alarming figures regarding the percentage in suffering from these conditions worldwide. The cardiac fibroblast (CF) plays a fundamental role in this matter, even more so when the literature indicates the senescent and fibrotic profile in a cell as responsible for the deterioration in the functioning of the heart. There is evidence that there is a close relationship between the presence of a population of senescent cardiac myofibroblasts (CMF) with myocardial infarctions, heart failure, among others. Senescence is defined as the irreversible arrest of the cell cycle together with a characteristic secretory profile associated with senescence, better known as SASP. TGF-β1 is a known proinflammatory, profibrotic, and prosenescent cytokine that CFs secrete in an autocrine manner, producing a change in their phenotype, orchestrating the transformation of a CF to a cardiac myofibroblast that is characterized by increased expression of α-SMA, and the subsequent assembly of this forming stress fibers. The persistence of the senescent profile has been described in the literature, presenting a marked resistance to apoptosis. A new pharmacological therapy targeting senescent cells has emerged in recent years, and these are the so-called "senotherapeutic" drugs. According to the literature, either by selectively inducing apoptosis in senescent cells (senolytic) or by modulating components of the SASP without inducing apoptosis (senostatic or senomorphic). In the present work, it was proposed to study the effect of the drugs navitoclax and Resolvin D1 (RvD1). From the above, the following hypothesis was proposed in this thesis: Resolvin and Navitoclax decrease the senescence of rat cardiac fibroblasts induced by TGF-β1. The objectives were: a) to establish a model of CMF senescence induced by TGF-β1, in parallel with the differentiation of CF to CMF. b) the second objective was to evaluate the effect of the senotherapeutic drugs in the senescent CMF of rats. To fulfill the purpose of this work, senescence-associated beta galactosidase activity (SA-β-gal) was measured in fibroblasts treated with TGF-β1, which are subsequently treated with navitoclax and RvD1. The methodology used was Western Blot, SA-β-gal assays, cytochemistry with crystal violet, and immunocytochemistry for α-SMA. The main results were that the treatment of CF of neonatal rats with TGF-β1 induced the differentiation of CF to CMF in parallel with the senescence of the CMF. This result was not statistically significant in adult rats cultured in DMEM-F12, DMEM-F12 + SFB1% and DMEM-F12 + SFB1% + SB-431542. An increase in p21 and a decrease in pRb were observed in senescent CMFs from neonatal rats. Treatment with navitoclax and RvD1 decreased SA-β-gal activity, p21 levels, and did not reverse the decrease in pRb. Similarly, TGF-β1 increased Bcl-XL levels and decreased Bax levels, and did not decrease procaspase levels, indicating that senescent CMFs are resistant to apoptosis. Navitoclax and RvD1 reversed the effects of TGF-β1. In conclusion, TGF-β1 induces senescence of neonatal rat CMFs which present resistance to apoptosis. Navitoclax and RvD1 showed senolytic effects