Papel de policistina 2 en la autofagia de la línea celular C2C12

Abstract

La “autofagia” es una vía de degradación lisosomal de proteínas y organelos necesaria para mantener la homeostasis celular. Defectos en la autofagia se han relacionado con diversas enfermedades, incluyendo desórdenes del músculo esquelético. La inducción de la autofagia requiere del complejo proteico PtdIns3K de clase III, el cual comprende entre otras proteínas a Beclin 1. Además, este proceso está regulado por la proteína mTOR, siendo la principal señal inhibitoria de autofagia controlada río arriba por PtdIns3K/Akt, mientras que la proteína sensora de nutrientes AMPK activa la vía autofágica. Policistina 2 (PC2) es un canal de Ca2+ codificado por el gen pkd2 y mutaciones de este gen causan la enfermedad renal poliquística (ADPKD). Estudios han mostrado una aumentada actividad de mTOR en riñones de pacientes ADPKD y el tratamiento con rapamicina mejora los síntomas y reduce la formación de quistes en un modelo animal de ADPKD. Esta tesis sugiere que PC2 regula la autofagia a través de la vía mTOR/AMPK y su asociación con Beclin 1 en células de músculo esquelético C2C12. Los objetivos planteados incluyeron: a) evaluar si PC2 es requerida para la autofagia inducida por privación de nutrientes y rapamicina en células C2C12; b) evaluar si PC2 inhibe la vía Akt/mTOR y regula positivamente a AMPK frente privación de nutrientes y rapamicina; c) evaluar si PC2 estimula la autofagia a través de la interacción con Beclin 1 en miotubos C2C12. Usando siRNA específicos contra PC2, se encontró que PC2 no fue necesaria para la autofagia inducida por rapamicina y privación de nutrientes en células C2C12. Además, se evaluaron las vías de señalización mTOR, AMPK y Akt y nuestros resultados mostraron que el siRNA de PC2 no previno la inhibición de la vía mTOR inducida por rapamicina y privación de nutrientes. Además, la fosforilación de AMPK no fue afectada por la privación de nutrientes y PC2 tampoco moduló la señalización de AMPK. Adicionalmente, la desfosforilación de Akt inducida por EBSS se atenuó en células transfectadas con el siRNA de PC2. Finalmente, se observó a través de ensayos de inmunoprecipitación, que PC2 se asoció a Beclin 1 en condiciones basales. Los resultados sugieren que PC2 no controla autofagia inducida por rapamicina y privación de nutrientes en células de músculo esquelético. Sin embargo, los datos muestran que PC2 regularía Akt, convirtiéndola en un nuevo blanco terapéutico para controlar esta vía transduccional

Autophagy is a lysosomal degradation pathway for proteins and organelles required to maintain cellular homeostasis. Defects in autophagy have been involved in several diseases, including skeletal muscle disorders. Autophagy induction requires class III PtdIns3K complex which comprises, among other proteins, Beclin 1. In addition, this process is regulated by the protein mTOR, the main autophagy inhibitory signal controlled upstream by PtdIns3K/Akt, while the nutrient sensor protein AMPK activates the autophagic pathway. Polycystin-2 (PC2) is a Ca2+ channel coded by the pkd2 gene and mutations in this gene (pkd2) cause polycystic kidney disease (ADPKD). Studies have shown increased mTOR activity in kidney of ADPKD patients and treatment with rapamycin improves PKD symptoms and reduces cysts formation in an animal model of ADPKD. This thesis suggests that PC2 regulates autophagy through the mTOR/AMPK pathway and its association with Beclin 1 in skeletal muscle cells C2C12. The objectives included to: a) evaluate if PC2 is required for starvation- and rapamycin-induced autophagy in C2C12 cells; b) evaluate if PC2 inhibits the Akt/mTOR pathway and positively regulate AMPK against starvation and rapamycin; c) evaluate if PC2 stimulates autophagy through the interaction with Beclin 1 in C2C12 myotubes. Using specific siRNA against PC2 it was found that PC2 is not necessary for rapamycin- or starvation-induced autophagy in C2C12. Furthermore, mTOR, AMPK and Akt signaling pathways were evaluated and our results showed that PC2 siRNA did not prevent rapamycin- and starvation-induced mTOR inhibition. Besides, AMPK phosphorylation was not affected by starvation and PC2 does not modulated the AMPK pathway. In addition, EBSS induced Akt dephosphorylation was attenuated in cells transfected with siRNA of PC2. Finally, it was observed by immunoprecipitation assay, that PC2 was associated with Beclin 1 at baseline. The results suggest that PC2 does not control rapamycin- or starvation-induced autophagy on skeletal muscle cells. However, the data show that PC2 would regulate Akt, being a new interesting therapeutic target to control this transductional pathway