Efecto de la inhibición de RHO kinasa por atorvastatina sobre la polarización de macrófagos infectados con trypanosoma cruzi

Abstract

La enfermedad de Chagas (EC) es una enfermedad causada por el protozoo Trypanosoma cruzi (T. cruzi). La fase crónica de la enfermedad se manifiesta principalmente como enfermedad gastrointestinal o cardiomiopatía chagásica crónica (CCC), que es la forma más seria de la enfermedad. El tratamiento actual de la enfermedad de Chagas es benznidazol, fármaco tripanocida que no disminuye los síntomas de la CCC cuando es administrado en la fase crónica. Debido a esto, se requiere una estrategia farmacológica que prevenga los efectos fisiopatológicos producidos en la CCC. Estudios histológicos de autopsias han revelado que los pacientes con CCC presentan una gran infiltración de macrófagos y consecuente fibrosis. Además, se ha observado que los pacientes con EC crónica asintomáticos tienen niveles altos de citoquinas antiinflamatorias (M2), lo que les protege del daño tisular, mientras que los pacientes con CCC secretan mayormente citoquinas proinflamatorias (M1), las que podrían ser las culpables de la miocarditis crónica. Es más, en ratones, el cambio de fenotipo hacia uno M2 está relacionado con una mejora en la función cardiaca. Además, las citoquinas M1 han demostrado ser causantes de la activación y disfunción endotelial, que conlleva a la formación de focos isquémicos en el tejido cardiaco. Por lo tanto, cambiar el fenotipo de macrófagos M1 proinflamatorios a M2 antiinflamatorios podría ser un mecanismo para prevenir la aparición de los cambios observados en la CCC. Rho Kinasa (ROCK) es una serina/treonina quinasa activada por la proteína G pequeña RhoA. ROCK tiene 2 isoformas; ROCK-1 y ROCK-2. Estas quinasas están implicadas en la polarización de macrófagos hacia M1, y su inhibición aumenta la población M2. Además, ROCK se ha relacionado con hipertrofia y fibrosis cardiaca en ratones. Por esta razón, ROCK podría ser un blanco farmacológico para el cambio de polarización de macrófagos en pacientes con CCC. La atorvastatina inhibe a la enzima HMG-CoA reductasa, inhibiendo a su vez la síntesis de isoprenoides importantes en la activación de GTPasas pequeñas como RhoA. El tratamiento con atorvastatina reduce la activación RhoA/ROCK en leucocitos y cambia la polarización de macrófagos de M1 a M2 en pacientes con aterosclerosis. De esta manera, la inhibición de ROCK por estatinas podría cambiar la polarización de macrófagos y reducir el daño tisular producido en la CCC. Por lo tanto, en este trabajo se propone que la inhibición de ROCK por atorvastatina promueve una polarización tipo M2 en macrófagos activados por T. cruzi, lo que disminuye su adhesión a células endoteliales. Para demostrar esta hipótesis, se incubaron macrófagos U937 inducidos con PMA con T. cruzi a distintos tiempos y se evaluó activación de ROCK por western blot. Para dilucidar la vía de señalización involucrada en la activación de ROCK, se trató con el inhibidor de TLR4, TAK-242, y además se evaluó la activación de la vía NF-κB por western blot e inmunofluorescencia. El rol de la activación de ROCK en la síntesis de citoquinas M1 y M2 se determinó usando el inhibidor de ROCK, Y27632, midiendo la expresión y secreción de citoquinas mediante RT-qPCR y Multiplex, respectivamente. Luego, se observó el efecto de atorvastatina sobre la activación de ROCK, y la polarización de macrófagos usando marcadores de cada fenotipo por RT-qPCR y Multiplex. Para evaluar la relación entre la inhibición de ROCK-1 o ROCK-2 por atorvastatina y su efecto sobre la polarización, se sobre-expresó ROCK-1 y ROCK-2 constitutivamente activos (CA) en los macrófagos, previo a la infección con T. cruzi y al tratamiento con atorvastatina. Finalmente, las citoquinas secretadas por los macrófagos incubados con T. cruzi y atorvastatina se cultivaron con células endoteliales microvasculares cardiacas (HMVEC-C) para determinar su efecto en la activación, mediante RT-qPCR de moléculas de adhesión, y sobre la adhesión a monocitos humanos. Este efecto de las estatinas sobre la expresión de ROCK y citoquinas M1 y M2 fue además determinado en tejido cardiaco de ratones con CCC tratado con simvastatina. Como resultado, se encontró que T. cruzi activó a ROCK en macrófagos humanos mediante la activación de TLR4, lo que indujo la activación de NF-κB. La inhibición de ROCK indujo una disminución de expresión y secreción de las citoquinas M1, un aumento de la expresión de los marcadores M2, y una disminución de la secreción de los marcadores M2. La relación M1/M2 (marcador de polarización) disminuyó en macrófagos tratados con Y27632. Por otro lado, atorvastatina inhibió la activación de ROCK inducida por T. cruzi, cambiando el fenotipo de macrófagos hacia M2, lo que fue prevenido por la expresión de ROCK-1 y ROCK-2 CA. Además, el cambio en el secretoma inducido por atorvastatina disminuyó la activación y adhesión de células endoteliales. Finalmente, los ratones con CCC aumentaron la expresión de ROCK-1, y de citoquinas M1, y disminuyeron la expresión de citoquinas M2, mientras que el tratamiento con simvastatina previno el efecto de CCC, observándose una relación positiva entre ROCK-1 y citoquinas M1, y una relación negativa entre ROCK-1 y citoquinas M2.

Chagas disease (CD) is caused by the protozoan Trypanosoma cruzi (T. cruzi). The chronic phase of the disease manifests mainly as gastrointestinal disease or chronic Chagasic cardiomyopathy (CCC), which is the most severe form of the disease. The current treatment for CD is benznidazole, a trypanocidal drug that does not reduce the symptoms of CCC when administered in the chronic phase. Therefore, a new pharmacological strategy is required to prevent the pathophysiological effects that produce CCC. Histological studies of autopsies have revealed that patients with CCC present a significant infiltration of macrophages and subsequent fibrosis. In addition, it has been observed that asymptomatic chronic CD patients have a prevalence of anti-inflammatory cytokines (M2), which protects them from tissue damage. In contrast, patients with CCC secrete mostly proinflammatory cytokines (M1), which could be the cause of chronic myocarditis. In vivo models of CCC have shown that the change in phenotype towards an M2 is related to an improvement in cardiac function. In addition, M1 cytokines have shown to cause endothelial activation and dysfunction, leading to the formation of ischemic foci in cardiac tissue. Therefore, changing the phenotype from proinflammatory M1 macrophages to immunoregulatory M2 could be a mechanism to prevent CCC. Rho Kinase (ROCK) is a serine/threonine kinase activated by the small G protein RhoA. ROCK has two isoforms: ROCK-1 and ROCK-2. These kinases are involved in the polarization of macrophages towards M1, and their inhibition increases the M2 population. For this reason, ROCK could be a pharmacological target for macrophage polarization change in CCC patients. Atorvastatin inhibits the HMG-CoA reductase enzyme, inhibiting the synthesis of isoprenoids critical in activating small GTPases such as RhoA. Atorvastatin treatment reduces RhoA/ROCK activation in leukocytes and changes macrophage polarization from M1 to M2 in patients with atherosclerosis. In addition, ROCK has been linked to cardiac hypertrophy and fibrosis in mice. Thus, ROCK inhibition by statins could change macrophage polarization and reduce tissue damage in CCC. Therefore, this thesis proposes that the inhibition of ROCK by atorvastatin promotes an M2-type polarization in macrophages activated by T. cruzi, which decreases endothelial cell adhesion. To determine this, PMA-induced U937 macrophages were incubated with T. cruzi at different times, and ROCK activation was evaluated by western blot. To elucidate the signaling pathway involved in ROCK activation, cells were treated with the TLR4 inhibitor, TAK-242. The activation of the NF-κB pathway was also evaluated by western blot and immunofluorescence. The role of ROCK activation in the synthesis of M1 and M2 cytokines was determined using the ROCK inhibitor, Y27632, and measuring cytokine expression and secretion by RT-qPCR and Multiplex, respectively. Then, the effect of atorvastatin on ROCK activation and macrophage polarization was observed using markers of each phenotype by RT-qPCR and Multiplex. To assess the relationship between the inhibition of ROCK-1 or ROCK-2 by atorvastatin and its effect on polarization, constitutively active ROCK-1 and ROCK-2 were overexpressed in macrophages before infection with T. cruzi and the atorvastatin treatment. Finally, the cytokines secreted by macrophages incubated with T. cruzi and atorvastatin were cultured with cardiac microvascular endothelial cells (HMVEC-C) to determine their effect on activation, using RT-qPCR of adhesion molecules, and on adhesion to monocytes. This effect of statins on the expression of ROCK and M1 and M2 cytokines was also determined in cardiac tissue from CCC mice treated with simvastatin. T. cruzi activated ROCK in human macrophages by TLR4, which induced NF-κB activation. ROCK inhibition decreased the expression and secretion of M1 cytokines, increased the expression of M2 markers, and decreased the secretion of M2 markers. The M1/M2 ratio was decreased in macrophages treated with Y27632. On the other hand, atorvastatin inhibited T. cruzi-induced ROCK activation, changing the macrophage phenotype towards M2, which was prevented by constitutive expression of ROCK-1 and ROCK-2. Finally, the change in the macrophage secretome induced by atorvastatin decreased endothelial cell activation and adhesion capacity.