Histatina-1 promueve la migración de células endoteliales mediante la unión y activación del receptor de VEGF tipo 2

Abstract

La regeneración de heridas en la cavidad oral es mucho más eficiente que en la piel, y esta característica es debida a distintos factores, siendo uno de los más destacados, la presencia de saliva. Por su parte, se ha demostrado que la saliva tiene actividad en procesos que participan en la regeneración, siendo algunos de los responsables de esta actividad, las histatinas. Las histatinas son péptidos de bajo peso molecular, expresadas en las glándulas salivales, que participan en la protección del esmalte dental y también destacan en su actividad antimicrobiana. Sin embargo, en los últimos años, se ha descrito que uno de estos péptidos, específicamente histatina-1, tiene una alta actividad regenerativa, induciendo la migración celular. Importantemente, se ha evidenciado actividad pro-migratoria de este péptido en distintos tipos celulares, en especial sobre células endoteliales, donde histatina-1 no sólo induce la migración celular, sino además favorece procesos como la formación de túbulos in vitro y la angiogénesis in vivo. Estos hallazgos han llevado a proponer a histatina-1 como potencial fármaco para nuevas terapias; no obstante, aún no se ha descrito la farmacodinamia de esta molécula. Es por esto, que proponemos a VEGFR-2 como el receptor de histatina-1 en el modelo endotelial. En este trabajo, identificamos a VEGFR-2 como el receptor de histatina-1 en células endoteliales. La inhibición específica y el silenciamiento de la expresión del receptor VEGFR-2 en células endoteliales elimina completamente el efecto pro-migratorio de histatina-1, indicando la participación del receptor en su actividad. Ensayos de proximity ligation assay (PLA) en células endoteliales indican un acercamiento espacial entre histatina-1 y VEGFR-2, fortaleciendo la idea de una unión directa entre estas dos moléculas, situación que fue confirmada a través de ensayos de inmunoprecipitación, pulldown con proteínas puras y pinzas ópticas. Experimentos de modelamiento y dinámica molecular indican que la interacción entre histatina-1 y VEGFR-2 es similar a la ocurrida entre este receptor y su ligando endógeno, VEGF-A, en donde los residuos F26, Y30 y Y34 de histatina-1 son análogos a los residuos F17, Y21 y Y25 en VEGF-A. Específicamente, estos residuos aromáticos en histatina-1 interaccionan con los dominios D2-D3 del receptor, mientras que su mutación triple por alanina, simulada por dinámica molecular, debilita la estabilidad de histatina-1 en el dominio de unión de VEGFR-2, situación que es confirmada en ensayos de pulldown con histatina-1 triple mutante. Además, la estimulación de células endoteliales con histatina-1 mutada en estos residuos elimina la actividad de migración y formación de túbulos in vitro. En resumen, nuestros hallazgos permiten describir a un receptor endotelial para histatina-1, situación que permitirá tener en conocimiento nuevas aplicaciones y cuidados para los futuros tratamientos en los cuales se vea involucrada este interesante péptido salival.

Wound healing in the oral cavity is much more efficient than in the skin, and this is due to different factors, including the presence of saliva. Saliva has been shown to promote tissue regeneration via molecules that include histatins. Histatins are low molecular weight peptides, expressed in the salivary glands, which participate in enamel protection and that harbor antimicrobial activity. However, in recent years, it has been described that one of these peptides, specifically histatin-1, depicts high regenerative activity, inducing cell migration. Histatin-1, which belongs to the histatin family, is composed of 38 residues and stands out for its high regenerative activity over the other histatins. Importantly, pro-migratory activity of this peptide has been reported in different cell types, namely endothelial cells, where histatin-1 not only induces cell migration, but it also promotes processes, such as tubule formation in vitro and angiogenesis in vivo. These findings led to propose histatin-1 as a potential drug for new therapies; however, the pharmacodynamics of this molecule has yet to be described. For this reason, we propose VEGFR-2 as the histatin-1 receptor in the endothelial model. In this work, we identified VEGFR-2 as the histatin-1 receptor in endothelial cells. Inhibition and siRNA-mediated targeting of VEGFR-2 in endothelial cells abrogated histatin-1-dependent cell migration, indicating that this receptor is involved in these responses. Proximity ligation assay (PLA) in endothelial cells showed spatial proximity between histatin-1 and VEGFR-2, further supporting the possibility that these proteins undergo direct binding. This possibility was confirmed by immunoprecipitation, pulldown assays with pure proteins and optical tweezers. Modeling and molecular dynamics experiments indicate that the interaction between histatin-1 and VEGFR-2 is similar to that described for this receptor and its endogenous ligand, VEGF-A, where histatin-1 residues F26, Y30 and Y34 were analogous to residues F17, Y21 and Y25 in VEGF-A. Specifically, these aromatic residues in histatin-1 interacted with the D2-D3 domains of VEGFR-2, whereas their triple alanine mutation, simulated by molecular dynamics, weakened the stability of histatin-1 in the VEGFR-2 binding domain, which was confirmed in pulldown assays with histatin-1 triple mutant. Finally, alanine mutation of these residues abolished migration and tubule formation activity in endothelial cells. In summary, our findings allowed us to describe the endothelial receptor for histatin-1, which will permit developing new applications and approaches to be considered for future treatments involving this peptide.