Participación del factor inhibitorio de leucemia en los niveles de acetilcolina y en la foliculogénesis ovárica en rata

Abstract

En las últimas décadas, se ha observado una tendencia de las mujeres a postergar su maternidad hacía edades más tardías, después de los 32 años. Este periodo de la vida reproductiva es denominado etapa de subfertilidad y corresponde al inicio del envejecimiento ovárico, caracterizado por una disminución logarítmica del número de folículos ováricos junto con una disminución simultánea en la calidad de los ovocitos, lo que se refleja en un mayor porcentaje de embriones con aneuploidías y una menor probabilidad de llevar a cabo embarazos exitosos. Por estos motivos es importante entender el funcionamiento ovárico, sobre todo, los mecanismos involucrados en la pérdida progresiva de sus funciones, como ocurre en contextos fisiológicos tales como el envejecimiento reproductivo. Uno de los factores involucrados en la función ovárica y que ha sido poco descrito es el Factor Inhibitorio de Leucemia (LIF), una citoquina proinflamatoria perteneciente a la familia de interleuquina 6 (IL-6), necesaria para la implantación del blastocisto en útero. LIF ha sido identificada a nivel ovárico y se presume que participaría en el desarrollo folicular y en la ovulación, pero a la fecha, se desconoce cómo regula localmente estas funciones en la etapa fértil de la rata. Por otro lado, estudios in vitro han demostrado que LIF favorece la síntesis de acetilcolina (ACh), la expresión de la enzima colin acetil transferasa (ChAT) y el aumento de la actividad de esta enzima en el ganglio cervical superior. En nuestro laboratorio, se ha demostrado que el ovario posee un sistema colinérgico no neuronal, que participa en la regulación de las funciones ováricas, favoreciendo la foliculogénesis y esteroidogénesis. En esta tesis se ha propuesto la siguiente hipótesis: LIF produce un aumento en los niveles de ACh ovárica, inhibe el reclutamiento inicial y favorece la ovulación en ovario de rata fértil y subfértil. Como objetivo general se propuso evaluar el rol del LIF sobre los niveles de acetilcolina ovárica, el reclutamiento inicial y ovulación en ovario de rata fértil y subfértil. Para esto, se llevaron a cabo experimentos in vivo e in vitro para evaluar el sistema colinérgico intraovárico de origen no neuronal, luego de tratar ovarios con 100 ng/ml de LIF, e in vivo para evaluar el desarrollo folicular y la fertilidad, en ratas fértiles y subfértiles. Los resultados muestran que, al evaluar el sistema colinérgico in vitro, LIF induce un aumento significativo de ACh en el medio de incubación, sin observar cambios en los niveles de ACh ovárica in vitro ni in vivo. Por otro lado, disminuye significativamente el contenido de mRNA de las enzimas ChAT y AChE, luego de 3h de incubación en ratas fértiles. Cuando evaluamos la foliculogénesis observamos que LIF disminuye el desarrollo folicular e induce un aumento de la hormona anti-mülleriana (AMH) sérica, pero también se favorece la formación de cuerpos lúteos (CL), lo que se ve reflejado en los altos niveles de progesterona sérica observados en ratas fértiles. En ratas subfértiles se observó que LIF no afecta el desarrollo folicular, pero si aumenta los CL pequeños, sin observarse cambios en los niveles de progesterona. Finalmente, al estudiar la fertilidad, se observó que LIF no afecta el número de implantaciones en los cuernos uterinos, ni crías vivas por rata en la etapa fértil. Los resultados permiten concluir que LIF participa en la función ovárica, regulando el desarrollo folicular y la esteroidogénesis en ratas fértiles y subfértiles. Los resultados sugieren que LIF favorece el proceso de ovulación, reflejado por el aumento del número de cuerpos lúteos y de los niveles séricos de progesterona. Finalmente, LIF participa en la regulación del sistema colinérgico en estudios ex vivo de ovario de ratas fértiles, pero para determinar si el efecto de LIF sobre las funciones ováricas es mediado por los niveles de ACh ováricos debe ser confirmada con futuros estudios.

In recent decades there has been a tendency for women to postpone childbearing until later in life, after the age of 32. This period of reproductive life is called the subfertility stage and corresponds to the beginning of ovarian aging, characterized by a logarithmic decrease in the ovarian follicles number together with a simultaneous decrease in the oocyte quality, which is reflected in a higher percentage of embryos with aneuploidy and a lower probability of successful pregnancies. For these reasons it is important to understand ovarian function, especially the mechanisms involved in the progressive loss of its functions as occurs in physiological contexts such as reproductive aging. One of the factors involved in ovarian function that has been little described is LIF, a proinflammatory cytokine belonging to the IL-6 family, necessary for blastocyst implantation in the uterus. LIF has been identified at the ovarian level and is presumed to participate in follicular development and ovulation, but to date, it is not known how it locally regulates these functions in the rat fertile stage. On the other hand, in vitro studies have shown that LIF favors the synthesis of ACh, the expression of the ChAT enzyme and the increase of the activity of this enzyme in the superior cervical ganglion. In our laboratory, it has been demonstrated that the ovary possesses a non-neuronal cholinergic system, which participates in the regulation of ovarian functions, favoring folliculogenesis and steroidogenesis. In this thesis it has been proposed as a hypothesis: leukemia inhibitory factor produces an increase in ovarian ACh levels, which favors ovarian folliculogenesis and fertility in rats in fertile and subfertile period. The general objective was to evaluate the role of LIF in ovarian function and its participation in the regulation of the cholinergic system in the ovary of fertile and subfertile rats. For this purpose, in vivo and in vitro experiments were carried out to evaluate the non-neuronal cholinergic system after treating ovaries with 100 ng/ml of LIF, and in vivo to evaluate follicular development and fertility in fertile and subfertile rats. The results show that, when evaluating the non-neuronal cholinergic system, LIF induces a significant increase of ACh in the incubation medium, without observing changes in ovarian ACh levels in vitro or in vivo. On the other hand, it significantly decreases the mRNA content of ChAT and AChE enzymes after 3h of incubation in fertile rats. When we evaluated folliculogenesis we observed that LIF decreases follicular development and induces an increase in serum AMH, but also favors the formation of corpora lutea, which is reflected in the high serum progesterone levels observed in fertile rats. In subfertile rats, it was observed that LIF does not affect follicular development, but it does increase small corpora lutea, without changes in progesterone levels. Finally, when studying fertility, it was observed that LIF does not affect the number of implantation of uterine bodies, nor live pups per rat in the fertile stage. It can be concluded that LIF participates in ovarian function, regulating follicular development and steroidogenesis in fertile and subfertile rats. The results suggest that LIF favors the ovulation process, reflected by the increase in the number of corpora lutea and serum progesterone levels. Finally, LIF participates in the regulation of the cholinergic system in ex vivo ovarian studies of fertile rats, but whether the effect of LIF on ovarian functions is mediated by ovarian ACh levels needs to be confirmed by future studies.