Prospección estratégica para la edición de genes reguladores negativos a estrés por sequía o salinidad en Solanum lycopersicum variedad poncho negro

Abstract

El cambio climático es un fenómeno global provocado por la acumulación de gases de efecto invernadero, el cual se encuentra asociado a mayores temperaturas y menores precipitaciones causando sequía y salinidad de los suelos, estreses abióticos que producen estrés osmótico en las plantas, afectando el desarrollo y rendimiento de los cultivos. Las plantas poseen mecanismos que les permiten adaptarse a condiciones temporales de sequía y baja salinidad. Durante este proceso se expresan genes que regulan negativamente a factores que promueven la tolerancia al estrés osmótico con el fin de recuperar la homeostasis una vez se retoma una condición ambiental normal. Experimentos de sobreexpresión de los reguladores negativos (RN) han mostrado que estos genes promueven la sensibilidad de la planta frente al estrés abiótico. Una de las principales estrategias para otorgar mayor tolerancia a los cultivos frente estrés abiótico es la edición de RNs mediante CRISPR-Cas9. El tomate es la hortaliza más cultivada en el mundo y tercera con mayor superficie en Chile; no obstante, las condiciones de sequía y salinidad que afectan la zona central de Chile amenazan su producción. El tomate Poncho Negro (PN) es un ecotipo local del Valle de Lluta, libre de protección intelectual y descrito como medianamente tolerante a sequía y salinidad. Si bien esta variedad es cultivada a pequeña escala, su mejoramiento genético podría incrementar su potencial al ser usado como portainjerto para variedades comerciales sensibles a sequía y sal. En base a lo anterior, en este trabajo estudiamos dos genes reguladores negativos a estrés por sequía y salinidad: OsDIS1 y TaACO1, E3 ubiquitina ligasa y enzima participante de la biosíntesis de etileno respectivamente. Se identificaron y analizaron sus genes ortólogos en el genoma de referencia de tomate, seleccionándose los genes SlDIS1, SlSINA5, SlSINAT2, SlACO1, SlACO2 y SlACO3 para evaluar sus niveles de expresión in silico bajo condiciones normales de cultivo. En base a lo anterior, se cuantificó la expresión bajo condiciones agudas de estrés osmótico y salino mediante RT-qPCR de aquellos genes que se expresaran en raíz, seleccionándose SlACO2 como candidato de edición ya que presentó mayor inducción en una de las condiciones de estrés estudiadas. Se estandarizaron las condiciones de propagación y regeneración in vitro del tomate PN. Finalmente, se transformaron explantes de PN para la edición del gen SlACO2, sin poder validar el knockout mediante PCR de punto final en el tejido transformante, por lo que no fue posible asegurar la edición del gen.

Climate change is a global phenomenon caused by greenhouse gases accumulation, which is associated with higher temperatures and less precipitations, causing drought and soil salinity, abiotic stresses that generate osmotic stress in plants, impairing crop development and yield. Plants as sessile organisms muist constantly adjust to their environment, for this they have developed mechanisms to adapt to temporal drought and low salinity conditions. During this process, genes that negatively regulate mechanisms which promote osmotic stress tolerance, are expressed aiming to recover homeostasis until normal environmental conditions are restored. It has been described that the overexpression of negative regulators (NR) promotes plant sensibility to abiotic stress; on the other hand, silencing these genes promotes tolerance. To improve plant abiotic stress tolerance, gene editing of NRs through CRISPR-Cas9 has become one of the main approaches to achieve this. Tomato was chosen as study model, as it is the most cultivated vegetable in the world and third with most surface cultivated in Chile; however, drought and salinity impair its yield. Tomato cv. Poncho Negro (PN) is a local ecotype from Lluta Valley, free of intellectual protection and described as moderately tolerant to drought and salinity. Therefore, genetic improvement of this variety will increase the value of a patrimonial variety with potential use as a commercial rootstock. Consequently, we studied two NR genes to drought and salinity stress: OsDIS1 and TaACO1, an E3 ubiquitin ligase and an enzyme involved in ethylene biosynthesis, respectively. Then, we identified and analyzed their orthologues in the tomato reference genome, selecting SlDIS1, SlSINA5, SlSINAT2, SlACO1, SlACO2 and SlACO3 to evaluate its expression level under normal culture conditions in silico. Based on this, the expression under acute osmotic and salt stress was quantified through RT-qPCR of those genes that were expressed in roots, selecting SlACO2 as a candidate for gene editing based on its observed induction under one of the stress conditions studied. Also, PN in vitro propagation and regeneration conditions were standardized. Finally, PN explants were transformed for SlACO2 knockout, without being able to validate the deletion by endpoint PCR in the transformant tissue, therefore it was not possible to ensure the knockout of the gene.