Rol de las modificaciones del lipopolisacárido de Salmonella enterica serovar Typhimurium en la resistencia a péptidos antimicrobianos y la supervivencia intracelular en Dictyostelium discoideum

Abstract

El lipopolisacárido (LPS) es un glicolípido complejo y componente mayoritario de la membrana externa de las bacterias Gram negativo que constituye la primera interfase de interacción y adaptación al ambiente. El LPS se compone de 3 dominios: el antígeno O (AgO), el core u oligosacárido central y el lípido A. Todos éstos pueden sufrir modificaciones estructurales para favorecer la supervivencia de la bacteria dentro del hospedero. Las alteraciones del lípido A afectan a la patogénesis de la bacteria al cambiar la permeabilidad de la membrana externa, promoviendo la resistencia a los péptidos antimicrobianos e interfiriendo con la capacidad del hospedero para reconocer el LPS. De la misma forma, se ha descrito que la ausencia del AgO afecta considerablemente a la supervivencia. Dentro de los genes involucrados en la modificación del LPS en Salmonella, se encuentran aquellos que codifican enzimas que modifican el lípido A, evitando la interacción de la bacteria con los péptidos antimicrobianos. Estos genes son eptA y el operón arnBCADTEF, que codifican enzimas que modifican químicamente a los grupos fosfatos, enmascarando la carga negativa del lípido A; y los genes lpxO, lpxR y pagP, los cuales codifican enzimas que modifican las cadenas aciladas del lípido A. Por último, el gen involucrado para ligar el AgO al lípido A es waaL. Todos estos genes de Salmonella han sido ampliamente estudiados, en específico en la interacción de ellos en células eucariontes de mamíferos, pero Salmonella no solo se enfrenta a este tipo de células. Durante su ciclo de vida, Salmonella debe sobrevivir en el medio ambiente, donde existe una amplia variedad de bacterias, bacteriófagos, plantas y en especial, está expuesta a la depredación por protozoos, incluyendo a las amebas. Para evitar esto, la bacteria ha desarrollado estrategias para sobrevivir dentro de estos organismos, logrando quedar protegida de condiciones ambientales desfavorables y transformando así a los protozoos en un reservorio ambiental. Es por esto que el propósito central de esta tesis se enfocó en estudiar los genes descritos para la supervivencia intracelular de Salmonella Typhimurium en células eucariontes de mamíferos: eptA, arnBCATDEF, waaL, lpxO, lpxR y pagP, y evaluar en primera instancia si estos genes contribuyen tanto para sobrevivir al péptido polimixina B en un ensayo de sensibilidad, como su aporte a la la supervivencia intracelular de Salmonella en las amebas, utilizando como modelo de estudio la ameba Disctyostelium discoideum. Para evaluar la supervivencia de las mutantes frente a péptidos antimicrobianos, se realizó un ensayo de sensibilidad al péptido polimixina B en el que las mutantes crecidas en un medio inductor del sistema PhoP/PhoQ se incubaron con distintas concentraciones del péptido para luego determinar el título de bacterias sobrevivientes. Nuestros resultados mostraron que las mutantes ΔarnBCADTEF y ΔwaaL de S. Typhimurium son más sensibles que la cepa WT a polimixina B, mientras que las otras mutantes no presentaron diferencias, siendo igual de sensibles que la cepa WT. Luego, se evaluó la supervivencia intracelular de todas las mutantes en D. discoideum AX2 mediante la realizaron ensayos de infección competitiva con una mezcla de cada cepa mutante y la cepa WT, usando una multiplicidad de infección de 100 bacterias/ameba. Los resultados de estos ensayos muestran que la supervivencia de las cepas ΔarnBCADTEF, ΔeptA y ΔlpxR en la ameba fue menor que la de la cepa WT. Por último, para evaluar si estos resultados se deben a la interacción con péptidos antimicrobianos de la ameba, se evaluó la supervivencia de las bacterias mutantes realizando ensayos de infección competitiva en una mutante de D. discoideum que es incapaz de producir el amebaporo AplD. Los resultados obtenidos muestran que las mutantes ΔarnBCADTEF y ΔeptA presentaron una supervivencia similar a la cepa WT cuando la ameba no produce este péptido, lo que indicaría que S. Typhimurium necesita expresar estos genes para poder sobrevivir a este amebaporo. En conjunto, nuestros resultados demuestran la importancia de las modificaciones del LPS en la resistencia a péptidos antimicrobianos y en la supervivencia intracelular dentro en la ameba D. discoideum.

Lipopolysaccharide (LPS) is a complex glycolipid and major component of the outer membrane of Gram-negative bacteria that constitutes the first interface of interaction and adaptation to the environment. LPS is composed of 3 domains: antigen O (AgO), the core or central oligosaccharide and lipid A. All of these can undergo structural modifications to favor the survival of the bacterium within the host. Lipid A alterations affect bacterial pathogenesis by changing the permeability of the outer membrane, promoting resistance to antimicrobial peptides, and interfering with the host's ability to recognize LPS. Likewise, it has been described that the absence of AgO significantly affects survival. Among the genes involved in the modification of LPS in Salmonella are those which encode enzymes that modify lipid A, preventing the interaction of the bacterium with antimicrobial peptides. These genes are eptA and the arnBCADTEF operon, which encode enzymes that chemically modify the phosphate groups, masking the negative charge of lipid A; and the lpxO, lpxR and pagP genes, which encode enzymes that modify the acylated chains of lipid A. Finally, the gene involved in binding AgO to lipid A is waaL. All these genes have been extensively studied, specifically their interaction in mammalian eukaryotic cells, but Salmonella does not only face this type of cells. During its life cycle, Salmonella must survive in the environment, where it is exposed to a wide variety of bacteria, bacteriophages, plants and especially to predation by protozoa, including amoebae. To avoid this, the bacteria have developed strategies to survive within these organisms, managing to be protected from unfavorable environmental conditions and thus transforming the protozoa into an environmental reservoir. For this reason, the main purpose of this thesis was focused on studying the genes described for intracellular survival of Salmonella Typhimurium in mammalian eukaryotic cells: eptA, arnBCATDEF, waaL, lpxO, lpxR and pagP, and to evaluate in the first instance whether these genes contribute both to survive the polymyxin B peptide in a sensitivity assay, and their contribution to the intracellular survival of Salmonella in amoebae, using the amoeba Disctyostelium discoideum as a study model. To evaluate the survival of mutants against antimicrobial peptides, a polymyxin B peptide sensitivity assay was performed in which mutants grown in a PhoP/PhoQ system inducing medium were incubated with different concentrations of the peptide and then determine the titer of surviving bacteria. Our results showed that the ΔarnBCADTEF and ΔwaaL mutants of S. Typhimurium are more sensitive than the WT strain to polymyxin B, while the other mutants showed no differences, being equally sensitive as the WT strain. Next, the intracellular survival of all mutants in D. discoideum AX2 was evaluated by performing competitive infection assays with a mixture of each mutant strain and the WT strain, using a multiplicity of infection of 100 bacteria/amoeba. The results of these assays show that the survival of the ΔarnBCADTEF, ΔeptA and ΔlpxR strains in the amoeba was lower than that of the WT strain. Finally, to assess whether these results are due to interaction with antimicrobial peptides from the amoeba, the survival of the mutant bacteria was evaluated by performing competitive infection assays on a D. discoideum mutant that is unable to produce the amoebapore AplD. The results show that the ΔarnBCADTEF and ΔeptA mutants presented similar survival to the WT strain when the amoeba does not produce this peptide, which would indicate that S. Typhimurium needs to express these genes to survive this amoebapore. Taken together, our results demonstrate the importance of LPS modifications in antimicrobial peptide resistance and intracellular survival in D. discoideum.