Obtención de acilglicéridos fenólicos con EPA/DHA y ácido gálico mediante acidólisis enzimática en medio CO2 supercrítico y su efecto sobre la reversión de alteraciones en parámetros bioquímicos asociados a resistencia a la insulina inducida por obesidad en modelo murino

Abstract

Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga omega-3 (AGPICLn-3) han obtenido una creciente atención en las últimas décadas. Nutricionalmente, los ácidos cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoico (20:5n-3, EPA) y cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoico (22:6n-3, DHA) son los más importantes en la familia omega-3. Su consumo ha sido asociado a una prevalencia menor de enfermedades no transmisibles [Ofosu et al., 2017] así como a la disminución de biomarcadores inflamatorios [Kavyani et al., 2022], la mortalidad y el riesgo cardíaco [Takahashi et al., 2017]. Por otra parte, el ácido gálico es un compuesto fenólico añadido a los alimentos como antioxidante, del cual se ha descrito que puede regular la homeostasis de la glucosa y de los lípidos [Ge et al., 2018; Donado-Pestana et al., 2018]. Esta información proporciona una base farmacológica para que pueda usarse como un metabolito antioxidante coadyuvante en hiperglicemia y resistencia a la insulina. Tanto el ácido gálico como los AGPICLn-3 podrían ser estructurados en acilglicéridos mediante reacciones enzimáticas empleando lipasas, por sus ventajas demostradas en la modificación de aceites [Chaurasia et al., 2016]. Estas estructuraciones enzimáticas pueden ocurrir en medio CO2 supercrítico, que permite acelerar la transferencia de masa en dichas reacciones [Budisa & Schulze-Makuch, 2014]. De esta forma sería posible obtener acilglicéridos fenólicos estructurados, que ofrezcan propiedades combinadas, tanto de los fenoles como de los AGPICLn-3, con el consumo de un único compuesto. El objetivo general de esta tesis fue obtener acilglicéridos fenólicos con EPA/DHA y ácido gálico mediante acidólisis enzimática en medio CO2 supercrítico y evaluar su efecto en la reversión de alteraciones en los parámetros bioquímicos asociados a resistencia a la insulina, inducida por obesidad en un modelo murino. El primer objetivo fue obtener un concentrado de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga n-3 (AGPICLn-3) mediante la optimización del proceso de complejación con urea. La optimización se realizó mediante Metodología de Superficie Respuesta (MSR) utilizando un diseño experimental de Box-Behnken para maximizar las variables respuestas contenido de EPA, DHA y EPA+DHA; siendo el aceite de salmón comercial refinado desodorizado (ASCRD) la materia prima de partida y obteniéndose finalmente un concentrado AGPICLn-3 óptimo con 41,33 g/100g AGT de EPA+DHA. El segundo objetivo contempló la estructuración de acilglicéridos con EPA/DHA (AEs) mediante reacciones de acidólisis enzimática (lipasa b de Candida antarctica) partiendo del concentrado AGPICLn-3 obtenido en el objetivo 1 y del aceite inicial (ASCRD). Estas reacciones se efectuaron en medio CO2 supercrítico y se optimizaron mediante MSR, maximizando el contenido de EPA, DHA, EPA+DHA, EPA/DHA en posición sn-2 del glicerol y minimizando el contenido de ácido palmítico. El tercer objetivo consistió en obtener acilglicéridos fenólicos estructurados (AFEs) utilizando la enzima lipasa de T. lanuginosus, para incluir ácido gálico en las posiciones sn-1/sn-3 del glicerol. Las materias primas de partida fueron el AEs obtenido en el objetivo 2 y el ácido gálico. Este proceso bajo condiciones de CO2 supercríticas se optimizó mediante MSR, maximizando el contenido de EPA, DHA, EPA+DHA y el porcentaje de síntesis de los acilglicéridos fenólicos (% acidólisis fenólica); resultando en un AFEs optimizado con 33,3% de acidólisis fenólica, 19,55 g/100g AGT de EPA+DHA y 12 ± 0,10 mg de ácido gálico por ml de AFEs. En el cuarto objetivo se evaluó el efecto de la suplementación con AFEs en la reversión de alteraciones de los parámetros bioquímicos asociados a resistencia a la insulina inducida por obesidad en un modelo murino. Se obtuvo una disminución significativa (*p < 0,05) del área bajo la curva de glucosa, la glicemia e insulina en ayunas, el índice HOMA y la grasa visceral en el grupo suplementado con AFEs, con respecto al grupo suplementado con aceite de maravilla (manteniéndose en ambos la dieta alta en grasas). Los resultados obtenidos confirman la hipótesis planteada de que es posible estructurar acilglicéridos fenólicos que contengan EPA/DHA y ácido gálico mediante acidólisis enzimática en medio CO2 supercrítico, y que el tratamiento con dichos estructurados fenólicos influye en la reversión de alteraciones en los parámetros bioquímicos asociados a resistencia a la insulina, inducida por obesidad en modelo murino.

Long-chain omega-3 polyunsaturated fatty acids (PUFALCn-3) have gained increasing attention in recent decades. Nutritionally, cis-5,8,11,14,17-eicosapentaenoic acid (20:5n-3, EPA) and cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaenoic acid (22:6n-3, DHA ) are the most important of the omega-3 family. Its consumption has been associated with a lower prevalence of non-communicable diseases [Ofosu et al., 2017] as well as a decrease in inflammatory biomarkers [Kavyani et al., 2022], mortality, and cardiac risk [Takahashi et al., 2017]. On the other hand, gallic acid is a phenolic compound added to food as an antioxidant, which has been described as able to regulate glucose and lipid homeostasis [Ge et al., 2018; Donado-Pestana et al., 2018]. This information provides a pharmacological basis for its use as an adjuvant antioxidant metabolite in hyperglycemia and insulin resistance. Both gallic acid and PUFALCn-3 could be structured into acylglycerides by enzymatic reactions using lipases due to their demonstrated advantages in modifying oils [Chaurasia et al., 2016]. These enzymatic structures can occur in a supercritical CO2 medium, which allows accelerating mass transfer in these reactions [Budisa & Schulze-Makuch, 2014]. In this way, it would be possible to obtain structured phenolic acylglycerides, which offer combined properties of phenols and PUFACLn-3, by consuming a single compound. The general objective of this thesis was to obtain phenolic acylglycerides with EPA/DHA and gallic acid by enzymatic acidolysis in a supercritical CO2 medium and to evaluate its effect on the reversal of alterations in the biochemical parameters associated with insulin resistance induced by obesity in a model murine. The first objective was to obtain a concentrate of n-3 long-chain polyunsaturated fatty acids (PUFALCn-3) by optimizing the urea complexation process. The optimization was carried out using the Response Surface Methodology (RSM) using a Box-Behnken experimental design to maximize the response variables EPA, DHA, and EPA+DHA content; refined deodorized commercial salmon oil (RDCSO) being the starting raw material and finally obtaining an optimal PUFALCn-3 concentrate with 41.33 g/100g TFA of EPA+DHA. The second objective contemplated the structuring of acylglycerides with EPA/DHA (AEs) by enzymatic acidolysis reactions (lipase b from Candida antarctica) starting from the PUFALCn-3 concentrate obtained in objective one and the initial oil (RDCSO). These reactions were carried out in a supercritical CO2 medium. They were optimized by RSM, maximizing the content of EPA, DHA, EPA+DHA, and EPA/DHA in the sn-2 position of glycerol and minimizing palmitic acid content. The third objective was to obtain structured phenolic acylglycerides (AFEs) using the enzyme lipase from T. lanuginosus, to include gallic acid in the sn-1/sn-3 positions of glycerol. The starting raw materials were the AEs obtained in objective two and gallic acid. This process under supercritical CO2 conditions was optimized by RSM, maximizing the content of EPA, DHA, EPA+DHA, and the percentage of synthesis of phenolic acylglycerides (% phenolic acidolysis), resulting in an optimized AFEs with 33.3% phenolic acidolysis, 19.55 g/100g TFA of EPA+DHA and 12 ± 0.10 mg of gallic acid per ml of AFEs. In the fourth objective, the effect of supplementation with AFEs on the reversal of alterations in biochemical parameters associated with insulin resistance induced by obesity in a murine model was evaluated. A significant decrease (*p < 0.05) was obtained in the area under the glucose curve, fasting glucose and insulin, the HOMA index, and visceral fat in the group supplemented with AFEs, compared to the group supplemented with sunflower oil (keeping both on the high-fat diet). The results confirm the hypothesis that it is possible to structure phenolic acylglycerides containing EPA/DHA and gallic acid by enzymatic acidolysis in a supercritical CO2 medium, and treatment with said phenolic structures influences the reversal of alterations in the biochemical parameters associated with insulin resistance induced by obesity in a murine model.