Estudio de adyuvantes basados en agonistas proteicos de TLR4, hemocianina de Fissurella latimarginata (FLH) y Proteína Inmunogénica de Superficie recombinante (rSIP) de Streptococcus grupo B, en la activación de las vías MyD88 y TRIF en células presentadoras de antígeno

Abstract

El desarrollo de adyuvantes de vacunas es de interés para la prevención de enfermedades infecciosas y futuras pandemia, así como tratamiento de enfermedades crónicas, cáncer. En este contexto, los Receptores Tipo Toll (TLR) se han estudiado en su acción como adyuvantes de vacunas. Los adyuvantes basados en ligandos de TLR4 son los más utilizados para vacunas humanas porque TLR4 tiene la capacidad única entre la familia de TLR de señalización dual, a través del reclutamiento de dos proteínas adaptadoras, el marcador de Diferenciación Mieloide 88 (MyD88) y el inductor del adaptador de interferón-β que contiene el dominio del receptor toll-interleukin-1 (TIR) (TRIF). La señalización mediada por MyD88 estimula reacciones de respuesta inmunitaria innata proinflamatoria, mientras que la señalización conducida por TRIF media una respuesta inmune adaptativa. La mayoría de los estudios han utilizado agonistas de TLR4 basados en lipopolisacáridos como adyuvantes; sin embargo, los mecanismos involucrados en señalización celular de los ligandos basados en proteínas agonistas de TLR4 han sido menos explorados; sin embargo, han mostrado ser ventajosos como adyuvantes dado su capacidad de modificar su estructura para una inmunogenicidad óptima y menor toxicidad. En esta tesis, se caracterizó el efecto de dos agonistas proteicos de TLR4 (APT4), con propiedades inmunomoduladores del tipo T helper 1 (Th1), sobre el reclutamiento de MyD88 y TRIF. Como modelos de APT4, se utilizaron la hemocianina de Fissurella latimarginata (FLH) y la proteína inmunogénica de superficie recombinante (rSIP) de Streptococcus agalactiae. La hipótesis propuesta y desarrollada fue que: “Los adyuvantes proteicos agonistas de TLR4, hemocianina de Fissurella latimarginata (FLH) y la proteína inmunogénica de superficie recombinante (rSIP) de Streptococcus grupo B, difieren en el reclutamiento y activación de las proteínas adaptadoras MyD88 y TRIF asociadas a la señalización de TLR4 y a la presentación de antígenos exógenos a linfocitos T CD8+”. El objetivo general fue estudiar la participación de FLH y rSIP como adyuvantes proteicos agonistas de TLR4 en la activación de las vías MyD88 y TRIF, y su efecto en la presentación de antígenos exógenos en el contexto del complejo mayor de histocompatibilidad de clase I (MHC-I) por células dendríticas (CDs) a linfocitos T CD8+. Con este propósito, se plantearon 2 objetivos específicos (OE). OE1: Caracterizar la inmunomodulación de los agonistas proteicos de TLR4, FLH y rSIP, asociadas a MyD88 y TRIF. OE2: Evaluar el efecto adyuvante de los agonistas proteicos de TLR4, FLH y rSIP, en la presentación cruzada de antígenos exógenos (Ovoalbúmina, OVA) dependientes de la activación de las vías MyD88 y TRIF en CDs. Los principales resultados muestran que rSIP y FLH son agonistas parciales de TLR4 y qué, independientemente del agonista de proteína utilizado, TLR4 tiene un sesgo único hacia la vía TRIF o MyD88. Además, al caracterizar los productos génicos dependientes de la ruta MyD88 y TRIF, se encontraron diferencias significativas en la señalización asociada a TLR4. Más aun, al comparar las vías usadas por estos APT4, se encontró que rSIP depende de la vía MyD88 en comparación con FLH, que se requiere para la secreción de interleucina 6 (IL-6) y la proteína 10 inducida por interferón gamma (IP-10). Sin embargo y, conjuntamente, rSIP y FLH requieren MyD88 y TRIF para activar el factor nuclear kappa beta (NF-κB) y el factor regulador de interferón (IRF). Finalmente, se encontró qué, funcionalmente, rSIP y FLH promueven la presentación cruzada de antígenos exógenos en células dendríticas derivadas de medula ósea (CD-MO) dependientes de la señalización de TLR4, MyD88 y TRIF. Los resultados describen por primera vez dos proteínas agonistas de TLR4, en que, su efecto, depende del reclutamiento de MyD88, TRIF y TLR4. Finalmente, es importante señalar que este trabajo es un respaldo al uso potencial de estos APT4 como adyuvantes de vacunas clínicas, al activar selectivamente la señalización dependiente de TRIF y MyD88 requerida para el desarrollo de una respuesta inmune innata segura e impulsar una respuesta inmune adaptativa Th1 vigorosa para conferir una potente inmunidad protectora.

The development of vaccine adjuvants is of interest for treating chronic diseases, cancer, and future pandemics, and in this context, Toll-like receptors (TLRs) have been investigated for their action as vaccine adjuvants. TLR4 ligand-based adjuvants are most widely used for human vaccines because TLR4 has the unique ability among the Toll-like receptor (TLR) family of dual signaling through the recruitment of two adapter proteins, the marker of myeloid differentiation 88 (MyD88) and the toll-interleukin-1 receptor (TIR) domain-containing adapter inducer of interferon-β (TRIF). MyD88-mediated signaling triggers proinflammatory innate immune response reactions, whereas TRIF-driven signaling mediates an adaptive immune response. Most studies have used lipopolysaccharide-based TLR4 agonists as adjuvants; however, the reaction mechanisms of the ligands based on TLR4 agonist proteins have been less explored; however, they are advantageous as adjuvants, including their ability to modify their structure for optimal immunogenicity and reduced toxicity. In this thesis, the effect of two protein-based adjuvants (PBAs) with T helper 1 (Th1) immunomodulatory properties on the recruitment of MyD88 and TRIF was characterized. As models of PBA4, we used hemocyanin from Fissurella latimarginata (FLH) and recombinant immunogenic surface protein (rSIP) from Streptococcus agalactiae. We hypothesized that: “The TLR4 agonist protein adjuvants, Fissurella latimarginata hemocyanin (FLH) and Streptococcus group B recombinant surface immunogenic protein (rSIP), differ in the recruitment and activation of the adapter proteins MyD88 and TRIF associated with TLR4 signaling and presentation of exogenous antigens to CD8+ T lymphocytes”. The general objective was to study the participation of FLH and rSIP as TLR4 agonist protein adjuvants in the activation of the MyD88 and TRIF pathways and their effect on the presentation of exogenous antigens in the context of the major histocompatibility complex class I (MHC- I) by dendritic cells (DCs) to CD8+ T lymphocytes. With this purpose, two specific objectives were proposed. O1: Characterize the immunomodulation of TLR4 protein agonists, FLH and rSIP, associated with MyD88 and TRIF. O2: Evaluate the adjuvant effect of TLR4 protein agonists, FLH and rSIP, in the cross-presentation of exogenous antigens (Ovoalbumin, OVA) dependent on the activation of the MyD88 and TRIF pathways in DCs. Among the main results, it was established that rSIP and FLH are partial agonists of TLR4 and that, regardless of the protein agonist used, TLR4 has a unique bias towards the TRIF or MyD88 pathway. Furthermore, by characterizing the MyD88 and TRIF pathway-dependent gene products, significant differences in TLR4-associated signaling were found. Furthermore, by comparing the pathways used by these PBAs, rSIP was found to be dependent on the MyD88 pathway as compared to FLH, which is required for secretion of the interleukin 6 (IL-6) and interferon gamma-induced protein 10 (IP-10). However, SIP and FLH require MyD88 and TRIF to activate nuclear factor kappa beta (NF-κB) and interferon regulatory factor (IRF). Finally, it was found that, functionally, rSIP and FLH promote the cross-presentation of exogenous antigens in bone marrow-derived dendritic cells (BMD-DCs) dependent on TLR4, MyD88 and TRIF signaling. Together, the results describe for the first time two TLR4 agonist proteins, in which their effect depends on the recruitment of MyD88, TRIF, and TLR4. Finally, it is important to note that this work supports the potential use of these APT4s as clinically vaccine adjuvants, by selectively activating TRIF and MyD88-dependent signaling required for the development of a safe innate immune response and driving a vigorous Th1 adaptive immune response to confer potent protective immunity.