Análisis de la heterodimerización entre el dominio de unión a ADN de los factores de transcripción humanos FoxP1 y FoxP2

Abstract

El intercambio de segmentos (IdS) es un mecanismo de asociación y plegamiento de proteínas que conlleva al intercambio de contenido de estructura secundaria, cuyo equilibrio se alcanza en tiempos de días-años y requiere una alta concentración de proteína. Un modelo de estudio que realiza IdS es el dominio de unión a ADN de la subfamilia FoxP, donde la asociación de algunos de sus miembros está favorecida, tanto cinética como termodinámicamente con respecto a los modelos de estudio clásicos de IdS. Sin embargo, antecedentes de la literatura solo evalúan la homodimerización in vitro de la subfamilia FoxP, conduciendo al planteamiento de la hipótesis de este trabajo que postula que es posible la heterodimerización entre los dominios de unión a ADN de FoxP1 y FoxP2 y que el ADN favorece tal asociación in vitro. De acuerdo con esto, se evaluó la heterodimerización mediante estudios cinéticos monitoreados por anisotropía de fluorescencia, observándose que, aunque la formación del homodímero de FoxP1 está favorecida con respecto a la del heterodímero, la constante de disociación (KD) del heterodímero es de ~ 3 órdenes de magnitud inferior a la del homodímero de FoxP2. Esto no sólo da cuenta de que la formación del heterodímero ocurre in vitro corroborando la hipótesis planteada, sino que además está favorecida respecto al homodímero de FoxP2 y a concentraciones fisiológicas. Adicionalmente, se procedió a la determinación de los parámetros energéticos de las reacciones de asociación y disociación utilizando la aproximación de Eyring, obteniendo información sobre la contribución entálpica y entrópica del heterodímero. Se observó que la barrera energética para alcanzar el estado de transición (ET) en la heterodimerización, es mayor respecto a la homodimerización de FoxP1 en ~ 4 kJ·mol-1, dando cuenta de las diferencias a nivel entálpico entre ambos dímeros. Finalmente, la presencia de ADN disminuye la constante de velocidad observada para la asociación del homodímero de FoxP1, sugiriendo que el complejo monómero-ADN es menos susceptible a la unión de un segundo monómero. Estos resultados dan cuenta del rol de las propiedades de dimerización en la actividad de regulación transcripcional de estas proteínas y su importancia en un contexto biológico, dado que las condiciones de dimerización de las proteínas FoxP son extrapolables a las condiciones de pH y temperatura fisiológicas.

Three-dimensional domain swapping (DS) is a unique folding and association mechanism which involves the exchange of identical structural segments between two monomers to form an intertwined dimer, although for a typical DS protein model, the association equilibrium takes between several days to years to be reached. The DNA-binding domain from human FoxP transcription factors is a model of a group of proteins that undergo DS. This association of some of its members is both kinetically and thermodynamically favored compared to classic DS study models. However, most investigations have evaluated only the homodimerization in vitro, leading to the hypothesis of this work which suggests that the heterodimerization between FoxP1 and FoxP2 is feasible and favored via binding to the cognate DNA. To test the hypothesis, both homodimerization of FoxP1 and its heterodimerization with FoxP2 were evaluated through kinetic assays by fluorescence anisotropy experiments. Our results show that FoxP1 dimerization is favored compared to the heterodimer association, whereas the heterodimer dissociation is favored with respect to the homodimer dissociation, with both events occurring at a physiological concentration. Interestingly, the dissociation constant (KD) for the heterodimer is ~ 3 orders magnitude lower than that of the FoxP2 homodimer. In addition, the Eyring approach was used to provide information about the enthalpic and entropic contribution of the kinetic reactions from homo- and heterodimers, indicating that the energy barrier that separates the monomers and the transition state (ET) during the heterodimerization process is ~ 4 kJ·mol-1 higher than for FoxP1 homodimerization. In notable contrast, the dissociation energy barrier of the homodimer is ~ 2 kJ·mol-1 higher than for the heterodimer, suggesting that enthalpic differences between both kinds of dimers explain most of their properties. Finally, incubation of the FoxP1 monomer with its cognate DNA decreases the homodimer association rate constant, suggesting that the monomer-DNA complex is less prone to bind a second monomer. These results give clues about the relationship between the dimerization properties of the proteins and their transcriptional regulation activity in a context that is close to conditions found in a biological environment.