Las vesículas de membrana externa (OMVs) de Helicobacter pylori inducen un fenotipo de astrocito reactivo a través de NF-ĸB provocando daño neuronal en un modelo murino

Abstract

Helicobacter pylori (H. pylori) infecta el estómago del 50% de la población mundial, aumentando la incidencia de patologías extragástricas, incluidas las enfermedades degenerativas. Los astrocitos, células macrogliales del cerebro, están implicados en la progresión de tales enfermedades porque cuando se exponen a un entorno inflamatorio se vuelven reactivos y neurotóxicos. A pesar de que hay estudios describiendo otras bacterias que llegan al cerebro en forma de pequeñas vesículas de la membrana externa (OMVs), no se sabe si las OMVs de H. pylori podrían llegar al sistema nervioso central (SNC). Aquí, probamos si la disponibilidad sistémica de OMVs de H. pylori afecta el cerebro activando a los astrocitos y dañando a las neuronas in vitro e in vivo. Para ello, aislamos OMVs de H. pylori 60190, y establecimos dosis/tiempo de tratamiento necesarios para la inducción de la reactividad de astrocitos. También evaluamos un posible mecanismo dependiente de NF-ĸB sobre la expresión de marcadores de reactividad en respuesta a las OMVs usando análisis por inmunoblots. La presencia de citoquinas proinflamatorias en el medio acondicionado de astrocitos tratados con OMVs (MCA) se ensayó usando el kit MILLIPLEX. Se probó, además, el efecto del MCA sobre la viabilidad de células tipo neuronas, la línea celular CAD. Adicionalmente, se marcaron las OMVs con DiR y se inyectaron en la vena de la cola de ratones BALB/c para evaluar la biodistribución de DiR-OMV en el cerebro. La expresión del marcador de reactividad de astrocitos GFAP y los marcadores de morfología neuronal Tubulina βIII y Thy-1 se evaluaron ex vivo mediante inmunofluorescencia de secciones de tejido coronal. Encontramos que las OMVs indujeron la reactividad de los astrocitos y la liberación de IFN-γ al medio extracelular mediante un mecanismo que implicaba la actividad de NF-ĸB. Finalmente, probamos que el MCA contenía factores neurotóxicos que inhibían el crecimiento de neuritas y dañaban a las neuronas in vitro. Además, encontramos OMVs de H. pylori en el cerebro de ratones inyectados por la vena de la cola, y la presencia de OMVs en el cerebro coincidió con la reactividad de los astrocitos y el daño neuronal. Por lo tanto, en este trabajo de tesis proporcionamos evidencia de que las OMVs de H. pylori llegan al cerebro alterando la función neuronal y de los astrocitos in vivo. Los efectos de las OMVs sobre los astrocitos se confirmaron in vitro y se describen como dependientes de NF-ĸB/IFN-γ. Estos hallazgos ayudan a aclarar cómo un patógeno gástrico como H. pylori puede alterar la homeostasis cerebral.

Helicobacter pylori (H. pylori) infects the stomach of 50% of the world's population, increasing the incidence of extragastric pathologies, including degenerative diseases. Astrocytes, macroglial cells of the brain, are involved in the progression of such diseases because they become reactive and neurotoxic when exposed to an inflammatory environment. Although there are studies describing other bacteria that reach the brain in the form of small outer membrane vesicles (OMVs), it is unknown whether the OMVs from H. pylori could reach the central nervous system (CNS). Here, we tested whether the systemic availability of H. pylori OMVs affects the brain by activating astrocytes and damaging neurons in vitro and in vivo. To this end, we isolated OMVs from H. pylori 60190 and established the dose/time of treatment required for the induction of astrocyte reactivity. We also evaluated a possible NF-ĸB-dependent mechanism on the expression of reactivity markers in response to OMVs by using immunoblot analysis. The presence of pro-inflammatory cytokines in the conditioned medium of astrocytes treated with OMVs (ACM) was assessed using the MILLIPLEX kit. The effect of AMC on the viability of neuron-like cells, the CAD cell line, was also tested. Additionally, OMVs were labeled with DiR and injected into the tail vein of BALB/c mice. DiR-OMV biodistribution in the brain was monitored. The expression of the astrocyte reactivity marker GFAP and the neuronal morphology markers Tubulin βIII and Thy-1 were evaluated ex vivo by immunofluorescence of coronal tissue sections. We found that OMVs induced astrocyte reactivity and IFN-γ release to the extracellular medium by involving NF-ĸB activity. Finally, we proved that ACM contained neurotoxic factors that inhibited neurite outgrowth and damaged neurons. Furthermore, we found H. pylori OMVs in the brain of mice injected through the tail vein, and the presence of OMVs in the brain coincided with astrocyte reactivity and neuronal damage. Therefore, in this thesis work, we prove that H. pylori OMVs reach the brain by altering astrocyte and neuronal function in vivo. The effects of OMVs on astrocytes were confirmed in vitro and described as dependent on NF-ĸB/IFN-γ. These findings help clarifying how a gastric pathogen like H. pylori could alter brain homeostasis.