Co-cultivo de Pophyromonas gingivalis y Helicobacter pylori aumenta la virulencia de P. Gingivalis y la migración de células epiteliales gingivales infectadas

Abstract

La periodontitis es una enfermedad polimicrobiana caracterizada por una inflamación sostenida que puede provocar la pérdida de los tejidos de soporte de las piezas dentales y su etiología se relaciona con procesos disbióticos de la comunidad microbiana que coloniza la placa subgingival. Una de las principales bacterias asociadas a este proceso es Porphyromonas gingivalis. En la biopelícula subgingival también se ha detectado la presencia de Helicobacter pylori, lo cual se ha asociado con mayor agresividad de la enfermedad y un aumento de patógenos periodontales, como P. gingivalis. Además, se determinó que la presencia de H. pylori en la biopelícula subgingival aumenta la liberación de citoquinas pro-inflamatorias como IL-8 y TNFα. Ambas citoquinas además se les conoce por activar al factor de transcripción NF-κB. La activación y el aumento de la expresión de proteínas como TRAF6 y ERK1/2, sugieren que la activación de NF-κB y el consecuente aumento en la expresión de citoquinas son producto de la activación de TLR4. En la biopelícula subgingival, se ha descrito que la interacción entre otros patógenos periodontales, como P. gingivalis y Treponema denticola, aumenta la expresión de algunos factores de virulencia en P. gingivalis, como hemaglutinina A y la Fimbria, ambos relevantes en los procesos de adhesión e invasión intracelular, los cuales permiten a P. gingivalis adherirse a células del epitelio gingival e internalizarse en ellas para escapar del sistema inmune y proliferar. Además, factores como gingipaínas, proteasas específicas de P. gingivalis tendrían un rol clave en procesos asociados a apoptosis y migración, procesos claves en la destrucción de los tejidos de soporte y formación del nicho ecológico donde la biopelícula subgingival coloniza. Por otra parte, se ha reportado que H. pylori puede interactuar con bacterias de la cavidad oral, y se sugiere que sus adhesinas podrían vincularla con otras bacterias. De acuerdo con esos antecedentes se propone que H. pylori pueda promover la virulencia de P. gingivalis en la biopelícula subgingival generando cambios en los procesos de sobrevida, proliferación, migración y muerte celular. Por tanto, se plantea la siguiente hipótesis: “Helicobacter pylori promueve la expresión de factores de virulencia en Porphyromonas gingivalis, aumentando la expresión de IL-8 y la migración celular en células epiteliales orales infectadas” Para resolver esta hipótesis, se co-incubó P. gingivalis y H. pylori en condiciones que permitan el crecimiento de ambas bacterias, y se determinó los efectos de la co-incubación sobre la virulencia de P. gingivalis y la expresión de factores de virulencia asociados a los procesos que promueven la progresión de la enfermedad (como hemaglutininas, gingipaínas y la ligasa del antígeno O del LPS) en P. gingivalis, mediante qPCR. Posteriormente se utilizó P. gingivalis previamente incubada con H. pylori para infectar células del epitelio gingival OKF6/TERT2 y determinar el perfil de citoquinas liberadas durante la infección, mediante qPCR y Multiplex. Finalmente, se determinó los efectos de la infección por P. gingivalis previamente incubada con H. pylori sobre procesos asociados a la progresión de la periodontitis, como la sobrevida (mediante MTS), proliferación (mediante ensayos de azul tripán) y migración (mediante ensayos de transwell) de células epiteliales gingivales. Además, se evaluó el rol de TLR4 en los cambios observados en los procesos anteriormente descrito. Los resultados obtenidos mostraron que es posible generar un medio de cultivo en donde P. gingivalis y H. pylori crezcan por 24 horas. Este co-cultivo bacteriano se realizó en todos los ensayos por 24 horas y luego P. gingivalis fue aislada para ser utilizada en los experimentos posteriores y evaluar los efectos del co-cultivo sobre su virulencia. Se observó que el co-cultivo de P. gingivalis y H. pylori promueven un aumento en la virulencia de P. gingivalis evaluado por un aumento en la capacidad de internalizarse en células del epitelio gingival OKF6/TERT2, un aumento en la capacidad de hemaglutinar glóbulos rojos y un aumento en la capacidad de formación de biopelícula, comparado con P. gingivalis sin co-cultivar. El co-cultivo también promueve un aumento en la expresión de ARNm de los genes rgpB (gingipaína en arginina B), hagA y hagC (hemaglutininas A y C), y genes asociados a la virulencia de P. gingivalis. Tambien se vió que al infectar células OKF6/TERT2, P. gingivalis co-cultivada con H. pylori promueve la expresión del ARNm de las citoquinas proinflamatorias IL-8 y TNFα y un aumento en la expresión proteica de IL-8. Además, encontramos un aumento de la migración de células epiteliales gingivales infectadas con P. gingivalis, el cual podría explicarse por el aumento en la expresión de las citoquinas y gingipaínas. Específicamente, se determinó que la inhibición de las gingipaínas por el inhibidor químico TLCK, no genera el aumento en migración de las células OKF6/TERT2 al ser infectadas por P. gingivalis co-cultivada. Estos cambios en migración podrían están regulados por la activación del receptor tipo toll TLR4, debido a que el knock-down de TLR4 mediante un small hairpin RNA (shRNA) contra TLR4 no promueve el aumento en migración observado. En conclusión, en este trabajo hemos demostrado que existe una relación entre P. gingivalis y H. pylori, y que su interacción promueve cambios en la virulencia de P. gingivalis, promoviendo un aumento en la expresión de citoquinas y migración celular al infectar células epiteliales gingivales.

Periodontitis is a polymicrobial disease characterized by sustained inflammation that can cause the loss of dental support tissues and its etiology is related to dysbiotic processes in the microbial community that colonizes the subgingival plaque. One of the main bacteria associated with this process is Porphyromonas gingivalis. In the subgingival biofilm, the presence of Helicobacter pylori has also been detected, which has been associated with greater aggressiveness of the disease and an increase in periodontal pathogens, such as P. gingivalis. Furthermore, it was determined that the presence of H. pylori in the subgingival biofilm increases the release of pro-inflammatory cytokines such as IL-8 and TNFα. Both cytokines are also known to activate the transcription factor NF-κB. The activation and increased expression of proteins such as TRAF6 and ERK1 / 2 suggest that the activation of NF-κB and the consequent increase in the expression of cytokines are a product of the activation of TLR4. In the subgingival biofilm, it has been described that the interaction between other periodontal pathogens, such as P. gingivalis and Treponema denticola, increases the expression of some virulence factors in P. gingivalis, such as hemagglutinin A and Fimbria, both relevant in the processes of intracellular adhesion and invasion, which allow P. gingivalis to adhere to and internalize cells of the gingival epithelium to escape the immune system and proliferate. In addition, factors such as gingipains, specific proteases of P. gingivalis, would play a key role in processes associated with apoptosis and migration, both important processes in the destruction of support tissues and the formation of the ecological niche where the subgingival biofilm colonizes. On the other hand, it has been reported that H. pylori can interact with bacteria in the oral cavity, and it is suggested that its adhesins could link it with other bacteria. In accordance with these antecedents, it is proposed that H. pylori can promote the virulence of P. gingivalis in the subgingival biofilm, generating changes in the processes of survival, proliferation, migration and cell death. Therefore, the following hypothesis is proposed: "Helicobacter pylori promotes virulence factor expression in Porphyromonas gingivalis, increasing IL-8 expression, and cell migration in infected oral epithelial cells" To resolve this hypothesis, P. gingivalis and H. pylori were co-incubated under conditions that allow the growth of both bacteria, and the effects of co-incubation on the virulence of P. gingivalis and the expression of virulence factors were determined. associated with processes that promote disease progression (such as hemagglutinins, gingipains, and LPS O-antigen ligase (OAg)) in P. gingivalis, using qPCR. Subsequently, P. gingivalis previously incubated with H. pylori was used to infect OKF6 / TERT2 gingival epithelial cells and determine the profile of cytokines released during infection, using qPCR and Multiplex. Finally, the effects of infection by P. gingivalis previously incubated with H. pylori on processes associated with the progression of periodontitis, such as survival (using MTS), proliferation (using trypan blue assays) and migration (using transwell migration assays) of gingival epithelial cells. In addition, the role of TLR4 in the changes observed in the processes described above was evaluated. The results obtained showed that it is possible to generate a culture medium where P. gingivalis and H. pylori grow for 24 hours. This bacterial co-culture was carried out in all the tests for 24 hours and then P. gingivalis was isolated to be used in subsequent experiments and to evaluate the effects of the co-culture on its virulence. It was observed that the co-culture of P. gingivalis and H. pylori promote an increase in the virulence of P. gingivalis evaluated by an increase in the ability to internalize in OKF6 / TERT2 gingival epithelial cells, an increase in the ability to hemagglutinate red blood cells and an increase in biofilm formation capacity, compared to P. gingivalis without co-cultivation. Co-culture also promotes an increase in mRNA expression of the genes rgpB (gingipain in arginine B), do and hagC (hemagglutinins A and C), and genes associated with virulence of P. gingivalis. It was also seen that when infecting OKF6 / TERT2 cells, P. gingivalis co-cultured with H. pylori promotes the mRNA expression of the pro-inflammatory cytokines IL-8 and TNFα and an increase in the protein expression of IL-8. Furthermore, we found an increase in the migration of gingival epithelial cells infected with P. gingivalis, which could be explained by the increase in the expression of cytokines and gingipains. Specifically, it was determined that the inhibition of gingipains by the chemical inhibitor TLCK, does not generate the increase in migration of OKF6 / TERT2 cells when infected by co-cultured P. gingivalis. These changes in migration could be regulated by the activation of the TLR4 toll-like receptor, since the knock-down of TLR4 by a small hairpin RNA (shRNA) against TLR4 does not promote the observed increase in migration. In conclusion, in this work we have shown that there is an interaction between P. gingivalis and H. pylori, and that their interaction promotes changes in the virulence of P. gingivalis, promoting an increase in the expression of cytokines and cell migration when infecting gingival epithelial cells.