Evaluación del efecto de extractos obtenidos desde frutos de Ugni molinae Turcz. sobre la agregación proteica asociada a enfermedades neurodegenerativas

Abstract

Dentro de los productos naturales más ampliamente distribuidos en el reino vegetal se encuentran los compuestos polifenólicos y más específicamente los flavonoides, de los cuales se han descrito alrededor de 10.000 compuestos hasta la fecha. Este tipo de compuestos se han estudiado principalmente debido a su capacidad antioxidante, pero diversos estudios también han demostrado que los flavonoides poseen propiedades antiinflamatorias, hipoglicemiantes, y neuroprotectoras. Diversas enfermedades neurodegenerativas son causadas por la acumulación y agregación de proteínas mal plegadas. Estas enfermedades, denominadas desordenes de malconformación proteica, incluyen entre otras a la enfermedad de Alzheimer, la enfermedad de Parkinson, la esclerosis lateral amiotrófica, y la enfermedad de Huntington. En esta última, una mutación en el gen que codifica para la proteína huntingtina (HTT), provoca una extensión en el número del aminácido glutamina (polyQ) que provoca la formación de agregados y, consecuentemente, la muerte de las neuronas. A pesar de los avances en el conocimiento de las bases moleculares de este tipo de enfermedades, hoy en día no existen tratamientos que prevengan, curen, o detengan el desarrollo de éstas. En este contexto, el análisis de extractos de plantas ricas en compuestos polifenólicos se posiciona como una estrategia prometedora para la búsqueda de terapias que prevengan o traten las enfermedades neurodegenerativas. La murtilla (Ugni molinae) es un berry nativo de Chile que se caracteriza por poseer una gran concentración de polifenoles y cuyas hojas han sido utilizadas por la medicina tradicional para el tratamiento de infecciones. Nuestro grupo ha analizado los efectos neuroprotectores de un extracto de hojas de murtilla silvestre en un modelo transgénico de la enfermedad de Alzheimer, observando que la administración del extracto previene el deterioro de la memoria y reduce la velocidad de la progresión de la enfermedad. Sin embargo, el efecto que podrían tener los frutos de murtilla en el contexto de las enfermedades neurodegenerativas no ha sido estudiado. El objetivo de este proyecto fue el de correlacionar la composición polifenólica de extractos obtenidos a partir de frutos de murtilla de 8 genotipos cultivados bajo las mismas condiciones edafoclimáticas, con sus efectos sobre la agregación proteica anormal relacionada al desarrollo de enfermedades neurodegenerativas. Se obtuvieron los extractos de diclorometano (EDCMs), acetona (EACs), y etanol acidificado (EEAs) por maceración consecutiva de los frutos liofilizados y triturados. Los EACs y los EEAs fueron seleccionados debido a que representan una fuente rica en polifenoles. Luego, se utilizaron diversas técnicas espectrofotométricas y cromatográficas para la caracterización química de los extractos (Folin-ciocalteu, CCF, CCF de alta resolución y CLAE-DAD), dando cuenta de la influencia del genotipo sobre la composición química de los frutos de murtilla. El análisis de viabilidad celular mostro una toxicidad sobre células HEK293 de los EACs a altas concentraciones, mientras que los EEAs mostraron bajas toxicidades a las concentraciones analizadas. Los efectos sobre la agregación proteica se analizaron a través de microscopía de fluorescencia automatizada utilizando un modelo celular donde se sobreexpresó un péptido con 79 repeticiones de polyQ (polyQ79) que se caracteriza por formar inclusiones intracelulares. Luego se validaron los resultados obtenidos analizando el efecto de 5 extractos seleccionados sobre los niveles de agregación de polyQ79 y también de HTT mutante (mHTTQ85), donde solo el EEA del genotipo 19-1 destacó por sus efectos sobre los niveles de agregación de ambos péptidos. Finalmente, el análisis por CLAE-ESI-EM/EM dio cuenta de la gran cantidad de compuestos polifenólicos presentes en los extractos seleccionados, confirmando diferencias existentes entre los genotipos. Estos resultados sugieren que las diferencias en el perfil de compuestos polifenólicos serían las responsables de las variaciones en sus efectos sobre la agregación proteica y, debido a que los frutos fueron cultivados bajo las mismas condiciones edafoclimáticas, las diferencias observadas se deben a las diferencias en el genotipo. Por lo tanto, debido a su baja citotoxicidad y efectos sobre la agregación proteica, el EEA 19-1 se posiciona como un candidato prometedor para análisis de sus efectos neuroprotectores en modelos in vivo de enfermedades neurodegenerativas, además de posicionarse como materia prima para el desarrollo de productos nutracéuticos.

Among natural products in the plant kingdom, polyphenolic compounds, and more specifically flavonoids, are among the most distributed. This type of compounds has been principally studied for their antioxidant properties, but several studies have demonstrated their anti-inflammatory, hypoglycemic and neuroprotective properties. Several neurodegenerative disorders are caused by the accumulation and aggregation of misfolded proteins. Among these diseases, commonly known as protein misfolding diseases (PMDs), Alzheimer’s disease, Parkinson’s disease, Amyotrophic lateral sclerosis and Huntington’s disease are included. In Huntington’s disease, a mutation in the gene encoding huntingtin (HTT) generates a glutamine extension (polyQ) which in turn facilitates aggregate formation and, consequently, the death of neurons. Although major advances have been made in the understanding of the molecular basis of these diseases, today there are no treatments that can prevent, cure or stop their development in humans. In this context, the analysis of polyphenolic rich plant extracts represents a promising strategy for the search of new therapies that can prevent or cure neurodegenerative diseases. Murtilla (Ugni molinae, Turcz.) is a native Chilean berry which is a major source of polyphenolic compounds, and whose leaves have been used by the folk medicine for the treatment of infections. Our group has analyzed the neuroprotective effects of a wild type murtilla leaves extract in a transgenic model of Alzheimer´s disease, observing that the oral administration of the extract prevents the detrimental effects over cognition and memory, reducing the rate of progression of the disease. In this context, the effect of murtilla fruits over neurodegeneration has not been studied. The aim of this study was to correlate the polyphenolic composition of extracts obtained from 8 murtilla genotypes cultivated under the same climate and soil conditions with their effects over the abnormal protein aggregation related to neurodegenerative disease development. Dichloromethane, acetone and ethanol (1% formic acid) extracts were obtained by consecutive maceration of the lyophilized and triturated fruits. Acetone extracts (EACs) and ethanol extracts (EEAs) were selected for analysis as they represent a rich source of polyphenolic compounds. Then, different spectrophotometric and chromatographic techniques were used (Folin-Ciocalteu, TLC, HPTLC, and LC-DAD) for the chemical characterization of the extracts, with results reflecting the influence on genotype over the chemical composition of the extracts. Cell viability analysis showed that EACs were toxic for HEK293 cell at high concentrations, meanwhile EEAs showed low levels of toxicity. The effect over protein aggregation was analyzed through automated fluorescence microscopy using a human cell model overexpressing a peptide that consisted on 79 repetitions of glutamine fused to EGFP (polyQ79-EGFP), which forms intracellular inclusions. 5 extracts were selected (SEs) for further validation through Western blot, analyzing the effect of their treatment over levels of polyQ79-EGFP and mHTTQ85-GFP aggregates. From this validation, only the treatment with EEA 19-1 had effects over the levels of both peptides. Finally, the analysis through LC-ESI-MS/MS showed a diversity of polyphenolic compounds in the SEs, confirming the differences among genotypes. These results suggest that the differences among the polyphenolic profile are responsible for the differences observed on the effects over toxicity and protein aggregation of the murtilla extracts and, as the fruits were cultivated under the same soil and climate conditions, those differences are due to genotype differences in the fruits. In conclusion, due to its low citotoxicity and effects over protein aggregation, EEA 19-1 represents a promising candidate for the analysis of its effects on in vivo models of neurodegenerative diseases, and for the development of nutraceutical products.