The therapeutic potential of dibenzoylmethane (DBM) in a C9ORF72-mediated FTD/ALS mouse model

Abstract

La causa genética más frecuente de C9FTD/ALS es la expansión repetida de hexanucleótidos en el gen C9ORF72. Esta mutación produce repeticiones de dipéptidos (DPR) que son neurotóxicas y forman cuerpos de inclusión. Estudios recientes sugieren que la producción de DPR condujo a la fosforilación del factor de iniciación de la traducción eIF2α y, por tanto, a la inhibición de la síntesis de proteínas. Este evento molecular es un punto convergente de varias señales de estrés, una vía conocida como respuesta integrada al estrés (ISR). Estudios en modelos celulares y de moscas indicaron que la inhibición del ISR protege contra la patogénesis de C9ORF72. Recientemente, se ha identificado un compuesto con un potencial prometedor conocido como dibenzoilmetano (DBM), que muestra el potencial de atenuación de la traducción inversa mediada por la fosforilación de eIF2α. Esta molécula proporcionó neuroprotección a ratones infectados por priones y animales transgénicos Tau. Por lo tanto, el objetivo de este proyecto fue investigar el impacto de la administración oral de DBM en la toxicidad asociada a la acumulación de DPR en FTD/ALS mediada por C9ORF72. Con este fin, se inyectó a los ratones recién nacidos con AAV que codifica AAV-2R o el AAV-66R expandido mediante inyección intracerebroventricular. A los dos meses de edad, los ratones se trataron por vía oral con 0,5% de mezcla de DBM en alimento en polvo ad libitum hasta el final del experimento (ocho meses). Al tercer y sexto mes de edad, se realizaron varias pruebas de comportamiento para investigar el impacto del tratamiento con DBM en la progresión de FTD/ALS mediada por C9ORF72. Luego, para determinar las consecuencias del tratamiento con DBM en el modelo de ratones FTD/ALS mediado por C9ORF72, se realizaron diferentes análisis histopatológicos y bioquímicos. Finalmente, con el fin de determinar los cambios moleculares generados por la inyección de AAV y definir los posibles mecanismos que explican los efectos protectores de DBM, realizamos proteómica cuantitativa del tejido cerebral de ratones C9ORF72-FTD/ALS. Encontramos que los ratones AAV-66R mostraron deterioro de la memoria a los 6 meses en comparación con los controles, como lo revelaron las pruebas NOR y NOL. La administración de DBM fue suficiente para prevenir tal deterioro en nuestro modelo de enfermedad de ratón C9ORF72-FTD/ALS. Además, los ratones AAV-66R mostraron inclusiones de poli(GA) y poli(GR) en el hipocampo y la corteza, pero raramente en el cerebelo. Además, se encontró un aumento en la expresión de GFAP e Iba1, marcadores de astrogliosis y microgliosis respectivamente, en ratones AAV-66R. Sin embargo, DBM no disminuyó significativamente la expresión de estos marcadores. Con respecto a la expresión de blancos rio abajo de la fosforilación de eIF2α, como Chop, Atf3, Trb3, además de Bip y Xbp1s, no encontramos diferencias en el nivel de expresión medido por PCR en tiempo real. Finalmente, mediante análisis proteómico encontramos que los principales términos alterados por DBM en ratones FTD/ALS mediados por C9ORF72 fueron la organización del citoesqueleto y los procesos metabólicos. En general, los resultados obtenidos en esta tesis doctoral sugieren un efecto protector luego de la administración farmacológica de DBM en la progresión de la patología destacando una posible nueva estrategia terapéutica en el tratamiento de C9FTD/ALS.

The most frequent genetic cause of C9FTD/ALS is a hexanucleotide repeat expansion in the C9ORF72 gene. This mutation produces dipeptide repeats (DPR) that are neurotoxic and form inclusion bodies. Recent studies suggest that DPR production led to the phosphorylation of the translation initiation factor eIF2α and hence blocking protein synthesis. This molecular event is a convergent point of several stress signals, a pathway known as integrated stress response (ISR). Studies in fly and cellular models indicated that inhibition of the ISR protects against C9ORF72 pathogenesis. Recently, a compound with promising translational potential known as dibenzoylmethane (DBM) has been identified, which reverses the translational attenuation mediated by eIF2α phosphorylation. This molecule provided neuroprotection to prion-infected mice and Tau transgenic animals. Therefore, the aim of this project was to investigate the role of oral delivery of DBM in the neurodegeneration associated to the accumulation of DPR in C9ORF72-mediated FTD/ALS in a mouse model. To this purpose, newborn pups were injected with AAV encoding AAV-2R or the expanded AAV-66R by intracerebroventricular injection. At two months of age, mice were orally treated with 0.5% of DBM mixture in powdered food ad libitum until the end of the experiment (eighth months later). At the third and sixth month of age, several behavioral tests were performed to investigate the impact of DBM treatment in the progression of C9ORF72-mediated FTD/ALS. Then, to determine the consequences of DBM treatment in the C9ORF72-mediated FTD/ALS mice model, different histopathological and biochemical analysis were performed. Finally, to assess the molecular changes generated by the AAV injection and define he possibly mechanisms explaining the protective effects of DBM, we performed unbiased quantitative proteomics of brain tissue of C9ORF72-FTD/ALS mice. We found that AAV-66R mice showed memory impairment at 6 months compared to controls, as revealed by the novel object recognition (NOR) and novel object location (NOL) tests. DBM administration was sufficient to prevent such impairment in our C9FTD/ALS mouse model. Additionally, AAV-66R mice developed inclusions of poly(GA) and poly(GR) in the hippocampus and brain cortex, but rarely in cerebellum. Moreover, an increase in the expression of GFAP and Iba1, markers of astrogliosis and microgliosis respectively, were found in AAV-66R mice. However, DBM did not significatively decrease the expression of these markers. Regarding to the expression of downstream targets of eIF2α phosphorylation, DBM administration did not reduce markers of stress including Chop, Atf3, Trb3, in addition to Bip and Xbp1s, by real time PCR. Finally, by proteomics analysis indicate that the main pathways altered by DBM in C9ORF72-mediated FTD/ALS mice were related to cytoskeleton organization and metabolic processes. Overall, the results obtained in this PhD thesis suggest a protector effect of DBM in the pathogenesis of C9ORF72 highlighting a possible novel therapeutic strategy to treat C9FTD/ALS.