Rol de la mitofagia en la desdiferenciación de las células musculares lisas inducida por PDGF-BB

Abstract

Las células musculares lisas vasculares (VSMC) son el componente principal de la capa media de vasos sanguíneos. Gracias a su capacidad de contracción, se encargan de la regulación del tono vascular y la presión arterial. Estas células son capaces de modificar su fenotipo frente a señales ambientales. Al producirse daño vascular, las VSMC se desdiferencian a un fenotipo sintético proliferativo, caracterizado por una alta tasa de proliferación y migración celular, un aumento de la síntesis de componentes de matriz extracelular (ECM) y una reducción de marcadores específicos de VSMC, como son las proteínas contráctiles. La desdiferenciación desregulada/persistente de las VSMC corresponde a un evento común de distintas enfermedades cardiovasculares (ECV), principal causa de muerte tanto en Chile como en el mundo. El principal factor desdiferenciador de las VSMC es el factor de crecimiento derivado de plaquetas isoforma BB (PDGF-BB), que se libera al producirse una lesión vascular por las células endoteliales y las plaquetas. PDGF-BB se une a su receptor en la membrana de las VSMC, activando diferentes vías de señalización que culminan en la inhibición de la expresión de genes específicos del músculo liso y la inducción de la expresión de genes asociados a la proliferación. Se ha demostrado que en VSMC, PDGF-BB induce la autofagia, un mecanismo de degradación y reciclaje de los componentes citoplasmáticos. La inhibición de este proceso evita la adquisición del fenotipo sintético-proliferativo. Por otro lado, durante el cambio de fenotipo de las VSMC se han demostrado cambios tanto en la función como en la morfología mitocondrial. PDGF-BB induce la fisión mitocondrial, proceso de fragmentación de la red mitocondrial en mitocondrias de menor tamaño, y esta es requerida para la adquisición del fenotipo desdiferenciado en las VSMC. Sin embargo, todavía no se ha estudiado si existe una relación entre el cambio de fenotipo en las VSMC y el proceso de la mitofagia, un tipo autofagia selectiva que implica la degradación de las mitocondrias y que es precedida por la fisión mitocondrial. En este sentido, se propuso como hipótesis que: “En la desdiferenciación de las células musculares lisas vasculares de rata inducida por el factor derivado de plaquetas-BB (PDGF-BB) ocurre la activación de mitofagia”. Para ello se plantearon como objetivos específicos: 1) Determinar el efecto de PDGF-BB sobre la inducción de desdiferenciación en A7r5, 2) Determinar el efecto de PDGF-BB sobre la inducción de autofagia en A7r5 y 3) Determinar el efecto de PDGF-BB sobre la inducción de mitofagia en A7r5. Se utilizó como modelo de estudio de la línea de celular de VSMC de aorta de rata A7r5. Las células se trataron con 20 ng/mL de PDGF-BB a distintos periodos de tiempo, desde 0 a 360 minutos, y se evaluaron mediante Western blot marcadores de desdiferenciación (calponina, α-SMA y SM22), marcador de autofagia (p62), marcadores de mitofagia (PINK1, Parkin y BNIP3), y la proteína mitocondrial mtHsp70. Se determinó que la estimulación de las células con PDGF-BB disminuyó los niveles de proteínas contráctiles, produjo el aumento moderado de los niveles de p62 y el aumento de los niveles de PINK1, Parkin y BNIP3, pero no tuvo efecto en los niveles de la proteína mitocondrial mtHsp70. En base a los resultados obtenidos hasta el momento se podría concluir que durante el proceso de la desdiferenciación de las células A7r5 inducida por PDGF-BB, se activaría la mitofagia mediada por PINK y Parkin y probablemente también por BNIP3.

Vascular smooth muscle cells (VSMC) are the main component of the media layer of blood vessels. Thanks to their contractile ability, they are responsible for regulating vascular tone and blood pressure. These cells can modify their phenotype in response to environmental signals. In vascular damage, VSMC dedifferentiate to a proliferative synthetic phenotype, characterized by a high rate of cell proliferation and migration, increased synthesis of extracellular matrix (ECM) components, and a reduction in specific VSMC markers, such as contractile proteins. The uncontrolled/persistent dedifferentiation of VSMC is a common event in various cardiovascular diseases (CVD), a leading cause of death both in Chile and worldwide. The main dedifferentiating factor for VSMC is platelet-derived growth factor isoform BB (PDGF-BB), which is released during vascular injury by endothelial cells and platelets. PDGF-BB binds to its receptor on the VSMC membrane, activating different signaling pathways that result in the inhibition of smooth muscle-specific gene expression and the induction of genes associated with proliferation. It has been demonstrated that PDGF-BB induces autophagy in VSMC, a mechanism for the degradation and recycling of cytoplasmic components. Inhibition of this process prevents the acquisition of the synthetic-proliferative phenotype. Additionally, changes in mitochondrial function and morphology have been observed during the phenotypic transition of VSMC. PDGF-BB induces mitochondrial fission, a process involving the fragmentation of the mitochondrial network into smaller mitochondria, which is required for the acquisition of the dedifferentiated phenotype in VSMC. However, it has not yet been studied whether there is a relationship between the phenotypic transition in VSMC and the mitophagy, a selective autophagy involving the degradation of mitochondria that is preceded by mitochondrial fission. Therefore, the proposed hypothesis is that: 'Mitophagy is activated during the dedifferentiation of rat vascular smooth muscle cells induced by platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB).' The specific objectives were: 1) To determine the effect of PDGF-BB on the induction of dedifferentiation in A7r5, 2) To determine the effect of PDGF-BB on the induction of autophagy in A7r5, and 3) To determine the effect of PDGF-BB on the induction of mitophagy in A7r5. The VSMC cell line from rat aorta, A7r5, was used as the study model. Cells were treated with 20 ng/mL of PDGF-BB at different time periods, from 0 to 360 minutes, and evaluated using Western blot for dedifferentiation markers (calponin, α-SMA, and SM22), autophagy marker (p62), mitophagy markers (PINK1, Parkin, and BNIP3), and the mitochondrial protein mtHsp70. It was determined that PDGF-BB stimulation decreased contractile protein levels, moderately increased p62 levels, and increased PINK1, Parkin, and BNIP3 levels, but had no effect on the levels of the mitochondrial protein mtHsp70. Based on the results obtained so far, it could be concluded that during the dedifferentiation process of A7r5 cells induced by PDGF-BB, mitophagy mediated by PINK and Parkin, and probably also by BNIP-3, is activated.