17-β Estradiol previene la hipertrofia del cardiomiocito a través de la proteína ubiquitina ligasa E3 MUL1

Abstract

Antecedentes: Las enfermedades cardiovasculares (ECV) son la principal causa de muerte a nivel mundial. La insuficiencia cardiaca (IC), una ECV prevalente en Chile, está precedida por hipertrofia cardíaca (HC); la cual se caracteriza por ser una respuesta adaptativa, en su fase inicial, y que progresa con un aumento del tamaño del miocardio, disfunción contráctil, dilatación ventricular, cambios en el metabolismo cardíaco, reactivación del programa de genes fetales, para finalmente culminar con un corazón insuficiente. La prevalencia de HC e IC aumenta en las mujeres posmenopáusicas en comparación con los hombres de la misma edad. Se cree que la pérdida de estrógenos endógenos es un factor clave que induce ECV en mujeres posmenopáusicas. Por otro lado, se ha informado que los estrógenos previenen el desarrollo de HC en modelos murinos hembras y humanos. Sin embargo, los mecanismos de acción de estos esteroides sexuales no se comprenden aun completamente, siendo fundamental determinar los mecanismos por los cuales los estrógenos protegen el corazón en las mujeres premenopáusicas. El metabolito 17-β estradiol (E2) tiene funciones reguladoras a nivel mitocondrial que incluyen modulación de la síntesis de ATP, dinámica mitocondrial y producción de ROS. A su vez, en el corazón se describe la presencia de elevados niveles de MUL1, una proteína mitocondrial ligasa multifuncional de la membrana exterior de la mitocondria con un dominio Ring finger. MUL1 en condiciones fisiológicas actúa preferentemente como SUMO E3. MUL1, también cataliza la ubiquitinación de proteínas blancos, entre las que se incluye Mitofusina 2, afectando de esta forma al equilibrio dinámico entre la fisión y fusión mitocondrial, la cual es suficiente para promover HC. De esta forma, dos estudios independientes entre sí han mostrado que MUL1 es clave para el desarrollo de la HC. Sin embargo, se desconoce si el mecanismo protector mediado por E2, aún poco descrito, ocurre a través de la regulación de MUL1. Hipótesis de trabajo: 17-β estradiol previene la hipertrofia del cardiomiocito a través de la regulación negativa de la proteína mitocondrial ubiquitina ligasa E3 MUL1. Objetivos específicos: 1). Estudiar in vitro el efecto del 17-β estradiol sobre la hipertrofia del cardiomiocito inducida por norepinefrina en cultivos primarios de ratas neonatas. 2) Evaluar el efecto del 17-β estradiol en la regulación de los niveles de MUL1 en la hipertrofia del cardiomiocito inducida por norepinefrina en cultivos primarios de ratas neonatas. 3) Evaluar in vitro si la prevención de la hipertrofia del cardiomiocito por 17-β estradiol depende de MUL1. Diseño experimental: Se utilizaron cultivos primarios de cardiomiocitos ventriculares de ratas neonatas (NRVM) pretratados con E2 (0-100 nM) por 6 h y luego de manera conjunta con norepinefrina (NE) 20 μM por 48 h. Se determinó el marcador de hipertrofia ANP, mediante Western blot; el área celular y la morfología mitocondrial mediante la tinción de rodamina- faloidina y el marcador mtHsp70, respectivamente. La masa mitocondrial total y el potencial de membrana mitocondrial se determinaron por citometría de flujo usando las sondas Mitotracker Green (MTG) y tetrametilrodamina metil-éster (TMRM), respectivamente. En términos de MUL1, se determinaron sus niveles de mRNA y proteína mediante RT-qPCR y Western blot. Se silenciaron los niveles de MUL1 en el cardiomiocito mediante el uso de siRNA específicos; mientras que se sobreexpresaron sus niveles a través del uso de un adenovirus que codifica para la proteína MUL1 humana. Resultados: Los resultados muestran que: a) E2 (100 nM) previene la hipertrofia de cardiomiocitos inducida por NE, observándose una disminución de los niveles de la proteína pro-ANP y los niveles de mRNA de ANP, BNP y RCAN 1.4. b) E2 (100 nM) disminuyó significativamente el área de los cardiomiocitos tratados con NE. c) El pretratamiento con E2 (100 nM) de cardiomiocitos hipertróficos con NE evitó la fragmentación de la red mitocondrial. d) E2 (100 nM) disminuyó los niveles de proteína y mRNA de MUL1. e) El knockdown de MUL1 disminuyó los marcadores hipertróficos y recuperó la producción de ATP. f) La sobreexpresión de MUL1 en cardiomiocitos tratados con NE aumentó los marcadores de hipertrofia del cardiomiocito y disminuyó el efecto protector de los estrógenos sobre los niveles del mRNA de ANP. Conclusiones: En un modelo in vitro de NRVM, E2 disminuye la hipertrofia de los cardiomiocitos, previene el aumento de MUL1 y la fragmentación mitocondrial desencadenada por NE. Además, el knockdown y la sobreexpresión de MUL1 mostró que MUL1 está involucrada en la hipertrofia del cardiomiocito y que la protección mediada por los E2 cursa a través de la modulación de los niveles de esta proteína.

Background: Cardiovascular diseases (CVD) are the leading cause of death worldwide. Heart failure (HF), a prevalent CVD in Chile, is preceded by cardiac hypertrophy (CH); which is characterized as an adaptive response in its initial phase, and that progresses with an increase in myocardial size, contractile dysfunction, ventricular dilatation, changes in cardiac metabolism, reactivation of the fetal gene program, to finally culminate with a failing heart. The prevalence of CH and HF is increased in postmenopausal women compared to men of the same age. The loss of endogenous estrogen is thought to be a key factor inducing CVD in postmenopausal women. On the other hand, estrogens have been reported to prevent the development of CH in female murine and human models. However, the mechanisms of action of these sex steroids are not yet fully understood, and it is essential to determine the mechanisms by which estrogens protect the heart in premenopausal women. The metabolite 17-β estradiol (E2) has regulatory functions at the mitochondrial level that include modulation of ATP synthesis, mitochondrial dynamics, and ROS production. In turn, high levels of MUL1, a multifunctional mitochondrial protein ligase of the mitochondrial outer membrane with a ring finger domain, are described in the heart. MUL1 under physiological conditions acts preferentially like a SUMO E3. MUL1 also catalyzes the ubiquitination of target proteins, including Mfn2, thus affecting the dynamic balance between mitochondrial fission and fusion, which is sufficient to promote CH. Thus, two independent studies have shown that MUL1 is key to the development of CH. However, it is unknown whether the yet poorly described E2-mediated protective mechanism occurs through the regulation of MUL1. Hypothesis: 17-beta estradiol prevents cardiomyocyte hypertrophy through downregulation of the mitochondrial protein E3 ubiquitin ligase MUL1. Specific objectives: 1). To study in vitro the effect of 17-β estradiol on norepinephrine-induced cardiomyocyte hypertrophy in primary cultures of neonatal rats. 2) To evaluate the effect of 17-β estradiol on the regulation of MUL1 levels in norepinephrine-induced cardiomyocyte hypertrophy in primary cultures of neonatal rats. 3) To evaluate in vitro whether the prevention of cardiomyocyte hypertrophy by 17-β estradiol depends on MUL1. Experimental design: Primary cultures of neonatal rat ventricular cardiomyocytes (NRVM) pretreated with E2 (0-100 nM) for 6 h and then co-treated with 20 μM norepinephrine (NE) for 48 h were used. The ANP hypertrophy marker was determined by Western blot; the cell area and mitochondrial morphology were evaluated by rhodamine-phalloidin staining and the mtHsp70 marker, respectively. Total mitochondrial mass and the mitochondrial membrane potential were determined by flow cytometry using the dyes Mitotracker Green (MTG) and tetramethyl rhodamine methyl ester (TMRM). In terms of MUL1, its mRNA and protein levels were determined by RT-qPCR and Western blot. MUL1 levels in cardiomyocytes were silenced by using specific siRNAs; while their levels were overexpressed through the use of an adenovirus encoding a human MUL1. Results: The results show that: a) E2 (100 nM) prevented NE-induced cardiomyocyte hypertrophy, with a decrease in ANP protein levels and in the mRNA levels of ANP, BNP and RCAN 1.4. b) E2 (100 nM) significantly decreased the area of cardiomyocytes treated with NE and E2. c) E2 (100 nM) treatment of hypertrophic cardiomyocytes with NE prevented the mitochondrial network fragmentation. d) E2 (100 nM) decreased MUL1 protein and mRNA levels. e) MUL1 knockdown decreased the hypertrophic markers and recovered ATP production. f) MUL1 overexpression in NE-treated cardiomyocytes increased the cardiomyocyte hypertrophy markers and prevented the protective effects of estrogens on ANP mRNA levels. Conclusions: In an in vitro model of NRVM, E2 decreases cardiomyocyte hypertrophy, prevents MUL1 upregulation and NE-triggered mitochondrial fragmentation. Furthermore, knockdown and overexpression of MUL1 showed that MUL1 is involved in cardiomyocyte hypertrophy and E2-mediated protection courses through modulation of the levels of this protein.