Rol de los receptores de corticosteroides sobre la expresión de subunidades del receptor GABAA en hipocampo de ratas macho y hembra expuestas a estrés crónico

Abstract

El hipocampo es una estructura cerebral clave para los procesos de aprendizaje y memoria. Está conformado por circuitos excitatorios glutamatérgicos, y un sistema inhibitorio mediado por interneuronas que liberan ácido γ-aminobutírico (GABA), los que en conjunto ejercen un control fino de la función hipocampal. El GABA actúa sobre sus receptores ionotrópicos GABAA/GABAC y metabotrópicos GABAB, mediando en ambos casos una hiperpolarización neuronal. Diversos estudios en sujetos depresivos y en modelos preclínicos de exposición crónica a estresores indican atrofia neuronal en la corteza y áreas límbicas como el hipocampo. Esto sugiere la existencia de una conectividad alterada asociado con un desbalance de los sistemas glutamatérgicos y GABAérgicos. Sin embargo, el impacto del estrés sobre los eventos moleculares que regulan la neurotransmisión hipocampal GABAérgica son poco comprendidos. Una respuesta eficiente y adaptativa frente a un estresor involucra la activación rápida del sistema nervioso autonómico (SNA) seguido de una respuesta endocrina dada por la activación del eje hipotálamo-pituitariaadrenal (HPA) y la liberación de corticosteroides. Estas hormonas activan tanto receptores de mineralocorticoides (MRs) como de glucocorticoides (GRs) inhibiendo la actividad circadiana del eje HPA, y también en respuesta al estrés. Sin embargo, el estrés interrumpe y atenúa dicho sistema. De hecho, se sabe que el estrés crónico induce detrimentos en el comportamiento y respuestas específicas a nivel molecular en los polos dorsal y ventral del hipocampo. Además, se han determinado diferencias dependientes del sexo en la función, morfología y marcadores de plasticidad en el hipocampo. Así, se presume que los MRs y GRs podrían estar involucrados en la regulación del sistema GABAérgico a través de la modulación de la expresión de las subunidades que conforman sus receptores. Por último, se ha propuesto que la actividad de factores de transcripción (TFs) sería capaz de regular la expresión de las subunidades de los receptores GABAA (GABAAR), determinando así las propiedades del canal. En base a esto, se propuso como hipótesis que “La expresión de las subunidades del receptor GABAA modulada positiva o negativamente por el estrés crónico, está sometida a un control transcripcional sexo-dependiente directo e indirecto por los receptores de corticosteroides en el hipocampo de ratas”. Se realizaron análisis predictivos in silico y sustentados en bases de datos públicas para la identificación de potenciales regulaciones sobre la expresión génica de las subunidades del GABAAR. Además, se realizaron ensayos por RT-qPCR para evaluar el efecto del estrés crónico por restricción (CRS), del sexo biológico y de los tratamientos con fármacos antagonistas de los GRs (mifepristona) y MRs (espironolactona) sobre los niveles de mRNA de subunidades del GABAAR y TFs asociados en tejido hipocampal de ratas. De esta manera se determinó que el CRS es efectivo en la activación de mecanismos involucrados con la respuesta al estrés, sensibilizando la activación del eje HPA en las ratas macho. En comparación, las ratas hembra presentaron una mayor resiliencia al estrés, asociada a una activación eficiente del eje HPA. Por otra parte, se evidenció que en el hipocampo dorsal (HD) las subunidades Gabra5, Gabra3, Gabrd presentan diferencias de expresión asociadas al sexo biológico, siendo Gabra5, la única que presentó un efecto de interacción espironolactona x estrés. Adicionalmente, se determinó si el estrés y los antagonistas del GR y MR modificaban los niveles de transcritos de TFs que pudieran regular directamente la expresión de algunas subunidades de los receptores de GABA. Los resultados de esta tesis indican que los transcritos Sp1, Trp53 y Klf9 muestran sólo diferencias de expresión asociadas al sexo biológico en hipocampo dorsal, en donde los machos muestran niveles superiores a las hembras. Curiosamente, en HV no se evidenciaron diferencias asociadas al sexo, ni tampoco un efecto desencadenado por el estrés o los tratamientos farmacológicos. Como conclusión se determinó que los receptores de corticosteroides participan en un mecanismo de regulación directa, negativa y sexo-dependiente para la expresión del Gabra5 en HD. Así, bajo el contexto de CRS la expresión del transcrito estaría siendo reprimida por el GR en los machos, y por el MR en las hembras. En el mismo contexto, el transcrito Gabra3 sufre de una plausible regulación directa negativa mediada por el GR en el HD de ratas macho. Adicionalmente, bajo el contexto de CRS, el GR participaría de un mecanismo de regulación indirecta de la expresión de Gabrd, a través de la represión de los niveles de mRNA del Sp1 en el HD de ratas macho. Estos resultados contribuyen a la comprensión de los mecanismos involucrados en la fisiopatología de las enfermedades neuropsiquiátricas, estableciendo nuevos blancos farmacológicos, y favoreciendo el desarrollo de nuevos tratamientos más seguros y eficaces, para la mejora de la calidad de vida de las y los pacientes.

The hippocampus is a key brain structure for learning and memory processes. It is composed of excitatory glutamatergic circuits and an inhibitory system mediated by interneurons that release γ-aminobutyric acid (GABA), which together exert fine control over hippocampal function. GABA acts on its ionotropic GABAA/GABAC and metabotropic GABAB receptors, inducing neuronal hyperpolarization in both cases. Many studies in depressed subjects and preclinical models of chronic stress exposure indicate neuronal atrophy in the cortex and limbic areas such as the hippocampus. This suggests the existence of an altered connectivity associated with an imbalance of glutamatergic and GABAergic systems. However, the impact of stress on the molecular events regulating hippocampal GABAergic neurotransmission is poorly understood. An efficient and adaptive response to a stressor involves the rapid activation of the autonomic nervous system (ANS), followed by an endocrine response mediated by the activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis and the release of corticosteroids. These hormones activate both mineralocorticoid receptors (MRs) and glucocorticoid receptors (GRs), inhibiting the circadian activity of the HPA axis and also responding to stress. However, stress disrupts and attenuates this system. In fact, it is known that chronic stress induces impairments in behavior and specific molecular responses in the dorsal and ventral poles of the hippocampus. Additionally, sexdependent differences have been determined in the function, morphology, and plasticity markers in the hippocampus. Thus, it is presumed that MRs and GRs could be involved in the regulation of the GABAergic system through the modulation of the expression of the subunits that form their receptors. Thus, it has been proposed that the activity of transcription factors (TFs) is capable of regulating the expression of the subunits of GABAA receptors (GABAARs), thereby determining the properties of the channel. Based on this, it was hypothesized that “The expression of GABAA receptor subunits, positively or negatively modulated by chronic stress, is subject to direct and indirect sex-dependent transcriptional control by corticosteroid receptors in the rat´s hippocampus”. In silico predictive analyses were performed, supported by public databases to identify potential regulations on the gene expression of GABAAR subunits. In addition, RT-qPCR assays were conducted to evaluate the effect of chronic restraint stress (CRS), biological sex, and treatments with antagonists of GRs (mifepristone) and MRs (spironolactone) on mRNA levels of GABAAR subunits and associated TFs in rat hippocampal tissue. Thus, it was determined that CRS is effective in activating mechanisms involved in the stress response, sensitizing the activation of the HPA axis in male rats. In comparison, female rats showed greater resilience to stress, associated with efficient activation of the HPA axis. On the other hand, it was evident that in the dorsal hippocampus (HD), the Gabra5, Gabra3, and Gabrd subunits exhibit sex-associated expression differences, with Gabra5 being the only one showing a spironolactone x stress interaction effect. Additionally, it was determined whether stress and GR and MR antagonists modified the levels of transcripts of TFs that could directly regulate the expression of some GABA receptor subunits. The results of this thesis indicate that the transcripts of Sp1, Trp53, and Klf9 just show sex-associated expression differences in the dorsal hippocampus, where males exhibit higher levels than females. Interestingly, no sexassociated differences were found in the ventral hippocampus (HV), nor were there any effects triggered by stress or pharmacological treatments. In conclusion, corticosteroid receptors participate in a direct, negative, and sex-dependent regulatory mechanism for Gabra5 expression in the HD. Thus, under the CRS context, the transcript expression would be repressed by GR in males and by MR in females. In the same context, the Gabra3 transcript undergoes plausible direct negative regulation mediated by GR in the HD of male rats. Additionally, under the CRS context, GR would participate in an indirect regulatory mechanism of Gabrd expression through the repression of Sp1 mRNA levels in the HD of male rats. These results contribute to the understanding of the mechanisms involved in the pathophysiology of neuropsychiatric disorders, particularly those associated with GABAergic system dysfunction, establishing new pharmacological targets, and promoting the development of safer and more effective treatments to improve the quality of life for patients.