VAPA es una proteína que interactúa y regula la actividad del canal TRPC6

Abstract

El cáncer de mama es uno de los tipos de cáncer diagnosticados con mayor frecuencia a nivel mundial y la primera causa de muerte asociada a cáncer entre las mujeres. Diversos estudios han demostrado que la progresión del cáncer de mama implica alteraciones en la dinámica intracelular del Ca2+, mediada por cambios en la expresión y/o regulación de la actividad de canales iónicos. Entre las diferentes familias de canales iónicos, en el contexto del cáncer de mama, se ha enfatizado el estudio de la superfamilia de canales TRP (del inglés Transient Receptor Potential), ya que ciertos miembros han sido propuestos como marcadores pronósticos en esta patología. Dentro de los miembros de la superfamilia TRP, destaca el canal catiónico no selectivo permeable a Ca2+, TRPC6. Estudios en líneas celulares de cáncer de mama, han informado que la expresión de TRPC6 se ve aumentada en células MCF-7 y MDA-MB-231. Consistentemente, TRPC6 está sobre expresado en muestras de adenocarcinomas ductales de mama humanos en comparación con tejido de mama no tumoral. Así mismo, diversos estudios han relacionado la expresión y actividad de TRPC6 con una mayor proliferación, migración e invasión celular en líneas celulares MCF-7 y MDA-MB-231. Por tanto, estudiar los mecanismos que regulan la localización y actividad de TRPC6 pueden ser relevantes en la búsqueda de nuevos blancos terapéuticos para el tratamiento del cáncer de mama. En este sentido, las interacciones proteína-proteína, han surgido como reguladores interesantes, debido a sus efectos en el tráfico, localización y actividad de canales iónicos, lo cual afecta los procesos celulares dependientes de estos. Estudios realizados por nuestro laboratorio, han mostrado por medio de espectrometría de masa que la proteína VAPA (del inglés VAMP-Associated Protein A) interactúa con TRPC6. VAPA es una proteína residente en la membrana del retículo endoplasmático que, a través de su interacción con proteínas que contienen un motivo llamado FFAT (del inglés two phenylalanines (FF) in an Acid Tract), participa en el tráfico de vesículas, formación de complejos proteicos y regulación de los niveles de fosfoinosítidos en la membrana plasmática; procesos que están involucrados en la modulación de la actividad de TRPC6. Además, análisis de la secuencia primaria de TRPC6 han sugerido un posible motivo FFAT en el extremo amino terminal, que podría mediar su interacción con VAPA. En base a los antecedentes planteados, este trabajo propone la siguiente hipótesis: “VAPA regula la actividad del canal TRPC6 a través de su unión a un motivo tipo FFAT”. Para poner a prueba esta hipótesis, el objetivo general de este trabajo fue: “Determinar el efecto de la interacción entre TRPC6 y VAPA en el influjo de Ca2+ mediado por el canal”. Aquí, validamos la interacción entre TRPC6 y VAPA a través de ensayos de coinmunoprecipitación en células HEK293. Además, demostramos que VAPA es un regulador negativo de la actividad de TRPC6, al reducir el influjo de Ca2+ inducido por carbacol en células HEK293 y MDA-MB-231. En conjunto, nuestros resultados sugieren que la interacción entre TRPC6 y VAPA, constituye un nuevo mecanismo regulador de la actividad del canal, que presenta a VAPA como una nueva proteína regulatoria de TRPC6. Proponemos que, estabilizar la interacción entre TRPC6 y VAPA, podría ser una estrategia novedosa para el tratamiento de patologías asociadas a una ganancia de función de TRPC6, cómo lo es el cáncer de mama.

Breast cancer is one of the most frequently diagnosed cancers worldwide and the leading cause of cancer-related death among women. Various studies have shown that breast cancer progression involves alterations in the intracellular dynamics of Ca2+, mediated by changes in the expression and/or regulation of ion channel activity. Among the different families of ion channels, in the context of breast cancer, the study of the TRP (Transient Receptor Potential) channel superfamily has been emphasized since certain members have been proposed as prognostic markers in this pathology. Among the members of the TRP superfamily, the non-selective cation channel permeable to Ca2+, TRPC6, stands out. Studies in breast cancer cell lines have reported that TRPC6 expression is increased in MCF-7 and MDA-MB-231 cells. Consistently, TRPC6 is overexpressed in human breast ductal adenocarcinoma samples compared to non-tumor breast tissue. Likewise, several studies have related the expression and activity of TRPC6 with increased cell loss, migration, and invasion in cell lines MCF-7 and MDA-MB-231. Therefore, studying the mechanisms that regulate the localization and activity of TRPC6 may be relevant in the search for new therapeutic targets for the treatment of breast cancer. In this context, protein-protein interactions have emerged as an interesting regulatory mechanism due to their effects on trafficking, localization, and ion channel activity. Mass spectrometry-based assays suggest that the VAPA protein (VAMP-Associated Protein A) interacts with TRPC6. VAPA is a protein resident in the membrane of the endoplasmic reticulum that, through its interaction with proteins containing a motif called FFAT (two phenylalanines (FF) in an Acid Tract), participates in vesicle trafficking, formation of protein complexes, and regulation of phosphoinositide levels in the plasma membrane; processes that are involved in the modulation of TRPC6 activity. Furthermore, analysis of the primary sequence of TRPC6 has suggested a possible FFAT motif at the amino terminus, which could mediate its interaction with VAPA. Based on the information presented, this work proposes the following hypothesis: "VAPA regulates the activity of the TRPC6 channel through its binding to an FFAT-type motif". The general aim was: "To determine the effect of the interaction between TRPC6 and VAPA on the influx of Ca2+ mediated by the channel". We validated the interaction between TRPC6 and VAPA through co-immunoprecipitation assays in HEK293 cells. Furthermore, we show that VAPA is a negative regulator of TRPC6 activity by reducing carbachol-induced Ca2+ influx in HEK293 and MDA-MB-231 cells. Together, our results suggest that the interaction between TRPC6 and VAPA constitutes a new regulatory mechanism of channel activity, presenting VAPA as a new regulatory protein of TRPC6. We propose that stabilizing the interaction between TRPC6 and VAPA could be a novel strategy for treating pathologies associated with TRPC6 gain-of-function, such as breast cancer.