Participación de los factores transcripcionales Fnr y ArcA en la dinámica estructural dependiente de oxígeno del lipopolisacárido y su impacto sobre la virulencia de Salmonella enterica serovar Enteritidis

Abstract

El lipopolisacárido (LPS) es el mayor componente de la superficie de bacterias Gram negativo y un importante mediador de las interacciones con el hospedero durante el ciclo infeccioso de bacterias patógenas. Tres dominios componen el LPS: el antígeno O (AgO), el core u oligosacárido central y el lípido A. Todos los dominios del LPS pueden sufrir modificaciones en respuesta a estímulos ambientales, sin embargo las modificaciones realizadas sobre el lípido A son las mayormente estudiadas debido a su impacto sobre la virulencia de bacterias patógenas. Por ejemplo, se ha establecido que estas modificaciones pueden aumentar la resistencia a péptidos catiónicos antimicrobianos producidos por el hospedero y ayudan a evadir el reconocimiento del lípido A por los receptores TLR4. Durante su ciclo infeccioso, Salmonella se ve enfrentada a distintas condiciones ambientales a las cuales se debe adaptar mediante la regulación de la expresión de sus genes. Se ha evidenciado que en condiciones que simulan el interior de la vacuola contenedora de Salmonella, esta bacteria altera la expresión de genes involucrados en la modificación del lípido A con el objetivo incrementar su supervivencia dentro de este compartimiento. No obstante, la regulación de la expresión de estos genes bajo otras condiciones que enfrenta Salmonella durante su ciclo infeccioso aún no ha sido estudiada. Dentro de este contexto, en el lumen intestinal Salmonella se debe adaptar a una disminución progresiva en la tensión de oxígeno. Para eso, esta bacteria cuenta con varios sensores que reconocen estos estímulos ambientales, los que a su vez activan a los reguladores de respuesta encargados de modificar la expresión de genes para adaptarse a esta condición. Tal es el caso del regulador global de respuesta Fnr y del sistema de dos componentes ArcA/ArcB. Previamente, en nuestro laboratorio se demostró por análisis de qRT-PCR que varios genes involucrados en la modificación del lípido A son regulados por la disponibilidad de oxígeno en forma dependiente de Fnr. En concordancia con los antecedentes expuestos, este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal determinar el rol de los factores transcripcionales Fnr y ArcA sobre los cambios en la estructura del LPS y el lípido A en respuesta a las variaciones en la disponibilidad de oxígeno y evaluar el efecto de esta respuesta sobre la virulencia de S. Enteritidis en Danio rerio (pez cebra). Más específicamente, se evaluó el efecto de la regulación oxígeno-dependiente ejercida por ArcA sobre la expresión de los genes lpxO y pagP. El gen lpxO codifica la dioxigenasa LpxO que hidroxila una cadena secundaria del lípido A de Salmonella, mientras que pagP codifica la palmitoil transferasa PagP, encargada de la acilación secundaria del lípido A. Estas modificaciones son relevantes dentro del ciclo infeccioso de Salmonella, ya que disminuyen la capacidad del lípido A de activar la respuesta inflamatoria en macrófagos. Sumado a lo anterior, se escogió estudiar estas modificaciones debido a que la expresión de los genes lpxO y pagP es regulada por la disponibilidad de oxígeno y, además, las especies hidroxiladas y/o palmitoiladas de lípido A ya habían sido identificadas en S. Enteritidis. En este trabajo de tesis se determinó, mediante la construcción de fusiones transcripcionales, que ArcA reprime la expresión de los genes lpxO y pagP en condiciones anaeróbicas de crecimiento, mientras que Fnr también reprime la expresión de lpxO bajo las mismas condiciones. En el caso de la regulación ejercida por ArcA, se demostró que esta regulación es directa ya que se predijo la existencia de tres sitios de unión a ArcA (ABS) en el promotor de estos genes, los cuales tienen la capacidad de unirse in vitro a ArcA fosforilada (ArcA-P). Además, mediante ensayos de cambio en la movilidad electroforética, se logró identificar los ABS principalmente responsables de esta interacción. La mutación puntual de estos ABS redujo la afinidad del promotor de lpxO por ArcA-P in vitro. Esta es la primera evidencia que demuestra que ArcA regula directamente la expresión de genes involucrados en la modificación del lípido A de Salmonella en respuesta a la disponibilidad de oxígeno. Con el objetivo de evaluar el impacto de esta regulación sobre la producción de LPS y la virulencia de S. Enteritidis, se construyeron mutantes por deleción génica de lpxO y pagP y además, se generaron mutantes regulatorias de los mismos genes que presentaban mutaciones puntuales en los ABS de sus promotores. Si bien se construyeron las mutantes regulatorias, éstas no pudieron ser utilizadas por diferentes razones. Por un lado, por razones que desconocemos la mutante regulatoria del gen lpxO no presentaba AgO, mientras que la mutante regulatoria del gen pagP presentaba inactivación de su promotor. Independiente a los problemas mencionados, se realizaron ensayos de infección por inmersión estática en pez cebra con cepas de S. Enteritidis. Así, se demostró que una mutante que carece del gen pagP presenta un fenotipo atenuado de virulencia cuando se compara con la cepa silvestre. Por otra parte, los resultados también indican que una mutante carente del gen lpxO presenta un fenotipo más virulento en comparación con la cepa silvestre. Para nuestro conocimiento, esta es la primera vez que se evalúa el impacto de las modificaciones del lípido A sobre la virulencia de Salmonella en Danio rerio.

Lipopolysaccharide (LPS) is the major component of the surface in Gram-negative bacteria and it is an important mediator of the interactions with the host during the infective cycle of pathogenic bacteria. LPS is composed by three domains: O antigen (OAg), core oligosaccharide and lipid A. All LPS domains can undergo modifications in response to environmental cues, however, lipid A modifications are the most studied because of their impact on the virulence of pathogenic bacteria. For instance, it has been stablished that these modifications can increase resistance to cationic antimicrobial peptides produced by the host, and also help to evade lipid A recognition by TLR4 receptors. During its infective cycle, Salmonella is faced with different environmental conditions to which it must adapt by regulating the expression of its genes. It has been shown that under conditions that mimic the interior of the Salmonella-containing vacuole, this bacterium changes the expression of genes involved in lipid A modification, with the aim of increasing its survival within this compartment. However, the regulation of the expression of these genes under other conditions that Salmonella encounters during its infective cycle has not been studied. Within this context, inside intestinal lumen Salmonella must adapt to the progressive decrease in oxygen tension. For this, this bacterium has several sensors that recognize these stimuli and activate response regulators which are in charge of modifying the expression of genes in order to adapt to this condition. Such is the case of the global response regulator Fnr and the ArcA/ArcB two-component system. Previously in our laboratory it was demonstrated, by qRT-PCR analysis, that several genes involved in the lipid A modification are regulated by oxygen availability in an Fnr-dependent manner. In agreement with the evidence presented above, the main objective of this thesis was to determine the role of the transcriptional factors Fnr and ArcA on the changes in the structure of LPS and lipid A in response to changes in oxygen availability, and to evaluate the effect of this response on the virulence of S. Enteritidis in Danio rerio (zebrafish) alternative model. More specifically, we evaluated the effect of oxygen-dependent regulation exerted by ArcA on the expression of lpxO and pagP genes. lpxO gene encodes the dioxygenase LpxO that hydroxylates a secondary acyl chain of lipid A in Salmonella, while pagP encodes the palmitoyl transferase PagP, responsible for the secondary acylation of lipid A. These modifications are relevant during Salmonella infective cycle, as they decrease lipid A ability to activate the inflammatory response within macrophages. In addition, we chose to study these modifications because lpxO and pagP expression is regulated by oxygen availability, and also, hydroxylated and/or palmitoylated lipid A species have been previously identified in S. Enteritidis. In this thesis, by the construction and analysis of transcriptional fusions it was determined that ArcA represses the expression of the lpxO and pagP genes in anaerobic growth conditions, while Fnr also represses the expression of the lpxO under the same growth conditions. In the case of the regulation exerted by ArcA, it was also shown that this regulation is direct, since the promoters of these genes have three putative ArcA binding sites (ABS) each and they are able to bind to phosphorylated ArcA (ArcA-P) in vitro. Also, by electrophoretic mobility shift assays, the ABS mainly responsible for these interactions were idenfied. Point-mutation of these ABS reduced the affinity of the promoters for ArcA-P in vitro. This is the first evidence describing that ArcA directly regulates the expression of genes involved lipid A modification in response to oxygen availability in Salmonella. In order to evaluate the impact of this regulation on LPS production and on the virulence of S. Enteritidis, lpxO and pagP deletion mutants were constructed and also, regulatory mutants for the same genes, which had point-mutations in the ABS of their promoters, were generated. Although these regulatory mutants were constructed, they could not be used because of different reasons. On one hand, for unknown reasons the lpxO regulatory mutant did not present OAg, whereas the pagP regulatory mutant had an inactive promoter. Despite of the aforementioned problems, infection assays by static immersion were carried out in zebrafish with S. Enteritidis strains. Thus, it was shown that a mutant lacking the pagP gene has an attenuated virulence phenotype when compared to a strain with a wild-type phenotype. Otherwise, the results also indicate that a mutant lacking the lpxO gene has an enhanced virulent phenotype when compared with the wild-type strain. To our knowledge, this is the first report on the impact of lipid A modifications on Salmonella virulence using the Danio rerio model.