Contribución de los factores de virulencia SopB, SptP y PphB de Salmonella entérica serovar Typhimurium en la modulación del proceso de autofagia en la ameba Dictyostelium discoideum y en macrófagos murinos

Abstract

Salmonella es una bacteria patógena capaz de generar cuadros clínicos que abarcan desde una gastroenteritis autolimitada hasta infecciones sistémicas que pueden causar la muerte del hospedero. El proceso infectivo de Salmonella comienza con la ingesta de alimentos o aguas contaminados con la bacteria, para posteriormente enfrentarse a las células epiteliales intestinales, primera barrera física del hospedero. Posteriormente interactúa con células fagocíticas profesionales del sistema inmune innato, causando una respuesta inflamatoria local que finalmente genera la eliminación de la bacteria al medio ambiente. Salmonella tiene la capacidad de sobrevivir intracelularmente en células fagocíticas como macrófagos, los que se transforman en verdaderos vectores de diseminación sistémica. Si bien se han estudiado en profundidad los mecanismos moleculares de esta bacteria para sobrevivir dentro de los macrófagos, existe escasa información referente a los mecanismos de supervivencia que emplea en otros estadios de su ciclo de vida. Por ejemplo, Salmonella pasa una parte importante de su ciclo de vida en el medio ambiente, compartiendo el hábitat con amebas. Estos organismos se alimentan principalmente de bacterias y hongos por fagocitosis y la digestión se produce dentro de fagolisosomas, un mecanismo antibacteriano similar al utilizado por macrófagos, como el proceso de autofagia. La autofagia es un mecanismo conservado en células eucariontes muy importante en la eliminación de proteínas mal plegadas y organelos dañados. La autofagia también desempeña un papel crucial durante la infección, actuando como un mecanismo de defensa contra patógenos intracelulares. Como consecuencia, muchos patógenos bacterianos han desarrollado la capacidad de evadir este proceso. La autofagia está regulada por numerosas vías de señalización intracelular en las que participa la proteína ERK, vinculada a la vía de las MAPK, y la proteína AKT, vinculada a la vía PI3K/AKT/mTORC1. Cabe destacar que Salmonella tiene factores de virulencia que intervienen en vías de señalización intracelular en la célula hospedera. Por ejemplo, la proteína SopB de Salmonella enterica serovar Typhimurium (S. Typhimurium) es una fosfatidilinositol fosfatasa que activa a AKT en células epiteliales, mientras que SptP es una proteína que tiene un dominio con actividad tirosina fosfatasa que regula negativamente a la proteína ERK en células epiteliales. Por su parte, PphB es una proteína no caracterizada con actividad serina/treonina fosfatasa hipotética. En esta tesis, nos propusimos evaluar si los factores de virulencia SopB, SptP y PphB modulan el proceso de autofagia, contribuyendo en la supervivencia intracelular de S. Typhimurium en la ameba Dictyostelium discoideum y en macrófagos murinos. Este estudio se llevó a cabo mediante ensayos de infección para evaluar la internalización y supervivencia intracelular de S. Typhimurium en D. discoideum AX4 y en macrófagos RAW264.7. Además, se realizaron ensayos de infección con la finalidad de monitorear mediante microscopía confocal cómo Salmonella modula la autofagia en la ameba y los macrófagos mencionados. Finalmente, mediante ensayos de western blot detectamos las proteínas AKT, ERK1/2, mTOR y sus formas fosforiladas activas en células infectadas ya que éstas participan en vías de señalización intracelular que regulan la autofagia y que Salmonella podría controlar durante el proceso infectivo. Nuestros resultados indican que S. Typhimurium requiere de los factores de virulencia SopB, SptP y PphB para sobrevivir intracelularmente en la ameba D. discoideum, pero no los requiere para sobrevivir en los macrófagos RAW264.7 bajo las condiciones experimentales utilizadas. Además, determinamos que los factores de virulencia SopB y SptP de S. Typhimurium modulan el proceso autofágico en la ameba D. discoideum y macrófagos RAW264.7. En macrófagos RAW264.7, SopB contribuye a la inhibición del proceso de autofagia tomando control de la vía AKT/mTORC1, mientras que SptP contribuye en la estimulación del proceso de autofagia de manera dependiente de AKT, pero independiente de mTORC1. Considerando que las proteínas efectoras SopB, SptP y PphB son importantes para la supervivencia intracelular de S. Typhmurium en D. discoideum, es válido pensar que Salmonella tomaría control de la autofagia con la finalidad de mantener un nicho replicativo estable y obtener nutrientes para su supervivencia intracelular en este hospedero. Finalmente, es importante destacar que en este trabajo de tesis se reporta por primera vez un rol para PphB en la virulencia de Salmonella. Además, es la primera vez que se reporta un rol para SopB, SptP y PphB en la internalización y supervivencia intracelular de Salmonella en protozoos.

Salmonella is a pathogenic bacteria that causes clinical manifestations ranging from self-limited gastroenteritis to systemic infections that can lead to the death of the host. The infective process of Salmonella begins with the ingestion of food or water contaminated with the bacteria, to later confront the intestinal epithelial cells, the first physical barrier of the host. It also has the ability to interact with professional phagocytic cells of the innate immune system, causing a local inflammatory response that ultimately results in the elimination of the bacteria in the environment. Salmonella has the ability to survive intracellularly in phagocytic cells such as macrophages, acting as vectors of systemic dissemination. Although the molecular mechanisms of this bacterium have been studied to survive within the macrophages, there is scarce information regarding the survival mechanisms used in other stages of its life cycle. For example, Salmonella spends an important part of its life cycle in the environment, sharing with amoebas. These organisms feed mainly on bacteria and fungi by phagocytosis and digestion occurs within phagolysosomes, an antibacterial mechanism similar to that used by macrophages, such as the autophagy process. Autophagy is a conserved mechanism in eukaryotic cells that is very important in the elimination of misfolded proteins and damaged organelles. Autophagy also plays a crucial role during infection, acting as a defense mechanism against intracellular pathogens. As a consequence, many bacterial pathogens have developed the ability to evade this process. Autophagy is regulated by numerous intracellular signaling pathways involving the ERK protein, linked to the MAPK pathway, and the AKT protein, linked to the PI3K / AKT / mTORC1 pathway. It is worth mentioning that Salmonella has virulence factors that interfere with intracellular signaling pathways in the host cell. For instance, SopB protein of S. Typhimurium is a phosphatidylinositol phosphatase that activates AKT in epithelial cells, whereas SptP protein has a tyrosine phosphatase domain that negatively regulates the ERK protein in epithelial cells. For its part, PphB is an uncharacterized protein with hypothetical serine / threonine phosphatase activity. In this thesis, we aimed to evaluate if the virulence factors SopB, SptP and PphB modulate the autophagy process, contributing to the intracellular survival of S. Typhimurium in the amoeba Dictyostelium discoideum and in murine macrophages. This study was carried out by means of infection assays to evaluate the internalization and intracellular survival of S. Typhimurium in D. discoideum AX4 and in RAW264.7 macrophages. In addition, infection assays were conducted with the purpose of monitoring by confocal microscopy how Salmonella modulates autophagy in the amoeba and in RAW264.7 macrophages. Finally, we detected AKT, ERK1/2, mTORC1 and their active phosphorylated forms in infected cells by western blot assays, as these proteins are linked to intracellular signaling pathways regulate autophagy and Salmonella could take control of them during infection. Our results indicate that S. Typhimurium requires virulence factors SopB, SptP and PphB to survive intracellularly in the amoeba D. discoideum. In contrast, the pathogen does not require these virulence factors them to survive in RAW264.7 macrophages under the experimental conditions used. In addition, we determined that virulence factors SopB and SptP of S. Typhimurium modulate the autophagy process in the amoeba D. discoideum and RAW264.7 macrophages. In these macrophages, SopB contributes to the inhibition of autophagy by taking control of the AKT / mTORC1 pathway, while SptP contributes to the stimulation of autophagy in an AKT-dependent manner, but independent of mTORC1. Taking into consideration that effector proteins SopB, SptP y PphB are important for intracellular survival of S. Typhmurium in D. discoideum, one can argue that Salmonella takes control of autophagy in order to maintain a stable replicative niche and obtain nutrients for its intracellular survival in this host. Finally, it is important to mention that in this thesis we reported for the first time a role for PphB in the virulence of Salmonella. In addition, we reported for the first time a role for SopB, SptP and PphB in the internalization and intracellular survival of Salmonella in protozoa.