Inactivación de genes de susceptibilidad mediante edición génica como método para generar resistencia al “Huanglongbing” en Citrus sinensis (L.) Osbeck

Abstract

El Huanglongbing es una enfermedad que ataca diversas especies de Citrus, causada por la proteobacteria ‘Candidatus Liberibacter (spp)’, parásito obligado en el floema de la planta. En busca de una alternativa para controlar la enfermedad, se propone implementar las bases técnicas que posibiliten la edición génica (EG) por CRISPR/Cas9 en Citrus, teniendo como objetivo la inactivación de potenciales genes de susceptibilidad al Huanglongbing. En este trabajo, se estableció un sistema de cultivo in vitro, evaluando distintos medios de propagación e inducción de callos para explantes de Citrus sinensis, donde se pudiera aplicar la EG. Estos experimentos mostraron que el mejor sistema de cultivo y regeneración se obtuvo utilizando segmentos internodales y los medios CiSM1.0 y CiCM, previamente en oscuridad, respectivamente. Para este último, se diseñaron editores génicos basados en Geminivirus, los que fueron ensamblados a través de la reacción Golden Gate, ligando el vector base pVK, conformado por cassettes de expresión de Cas9 y la proteína fluorescente verde (GFP), más una pareja de RNAs guías (gRNAs) diseñados a partir de la secuencia del gen candidato de susceptibilidad CsDMR6. El vector de edición pVK:CsDMR6-A fue evaluado por un sistema de agroinfiltración de hojas de C. sinensis. La expresión de GFP en los explantes indicó la transferencia del vector de edición a las células vegetales, validando la posibilidad de utilizar EG en la especie. Muestras de ADN aisladas después de ser agroinfiltrados fueron evaluadas por PCR y secuenciación, evidenciando una deleción aproximada de 5814 pb en el gen blanco, correspondiente a la acción conjunta de ambos gRNAs incluidos en el vector. La pérdida del fragmento génico permitió validar la construcción del vector pVK:CsDMR6-A, demostrándose que éste generó los cortes simultáneos en el gen CsDMR6, tal como se propuso. Ambas herramientas serán fusionadas en experimentación futura para generar plantas completas que serán evaluadas para el proceso de EG en el germoplasma utilizado.

Huanglongbing is a disease that infect various species of the Citrus genus and is caused by the proteobacterium Candidatus Liberibacter (spp), an obligate parasite in the phloem of the plant. In the search for alternatives practices to control the disease, we propose to develop gene edition (GE) as a tool that allows the inactivation of potential susceptibility genes associated to Huanglongbing. In this work, a GE-compatible in vitro culture system was first established, evaluating different propagation and callus induction media for C. sinensis explants. The best regeneration results were obtained using internode segments as starting explants and using CiSM1.0 and CiCM media for regeneration. For GE, a Geminivirus-based vector was assembled through the Golden Gate reaction, ligating the pVK vector (harboring Cas9 and green fluorescent protein (GFP) expression cassettes), to a pair of guide RNAs (gRNAs) designed for targeting the candidate susceptibility gene CsDMR6. The pVK:CsDMR6-A vector was evaluated by an Agrobacterium tumefaciens mediated gene transfer system of C. sinensis leaves. GFP expression in explants showed the gene transfer capability of the editing vector into plant cells. PCR analysis of DNA extracts obtained from agro-infiltrated leaf explants showed a deletion of 5,814 bp in the target gene. These results validated the effectiveness of the editing vector pVK:CsDMR6-A, by a double-cut of the CsDMR6 gene as expected. Both tissue culture and GE tools allow for future experimentation in which whole plants derived from this process will be generated and validated.