Efecto de Navitoclax sobre miofibroblastos cardiacos senescentes

Abstract

El miofibroblasto cardiaco (MFC) es una célula diferenciada proveniente del fibroblasto cardiaco (FC), una célula clave en la regulación de la matriz extracelular (MEC), y este proceso de diferenciación se produce en diferentes patologías y es crucial en el desarrollo de fibrosis cardiaca. Cuando los FC se diferencian a MFC, se produce un aumento en los niveles de la alfa actina del músculo liso (α-SMA), proceso que es mediado en gran medida por el Factor de crecimiento transformante beta 1 (TGF-β1) el cual es secretado en diferentes contextos como reparación de tejido; por ejemplo, en el caso de un infarto al corazón. Esta citoquina además promueve la diferenciación de células sanas a células senescentes, las que se caracterizan por una detención del ciclo celular junto con el desarrollo de un microambiente proinflamatorio y profibrótico, lo que origina una acumulación de células senescentes, las que en conjunto generan el denominado fenotipo secretor asociado a senescencia (SASP), conformado por un conjunto de citoquinas, quimioquinas y metaloproteasas que interactúan sobre las células cercanas modificándolas para que se transformen igualmente en células senescentes. Últimamente han sido estudiados una nueva clase de fármacos llamados senostáticos y senolíticos. Los primeros bloquean la acción del SASP sobre las demás células y los últimos eliminan las células senescentes por mecanismos de apoptosis, dentro de los cuales surge Navitoclax (ABT-263) como posible fármaco para eliminar estas denominadas células “zombies”. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio muestran un efecto senolítico de Navitoclax sobre los MFC por lo que se plantea la siguiente hipótesis: Navitoclax reduce el número de miofibroblastos senescentes y modifica el perfil de proteínas del SASP inducidos por TGF-β1. Se plantean los siguientes objetivos específicos: 1) Obtener MFC senescentes inducidos por TGF-β1 2) Determinar que Navitoclax disminuye el número de MFC por un mecanismo asociado a apoptosis 3) Determinar el perfil de citoquinas del SASP (IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α y MCP-1) de los MFC 4) Comprobar que Navitoclax modifica el SASP de los MFC inducidos por TGF-β1 Como modelo experimental, utilizamos FC de rata neonata tratados con TGF-β1 (10 ng/mL) por 7 días, y se evaluó el tamaño celular, niveles de proteínas de ciclo celular, pro y antiapoptóticas, actividad SA-β-Gal. Resultados: TGF-β1 aumenta el tamaño promedio celular, aumentó los inhibidoras de ciclinas dependientes de quinasas (iCDK) p15-p16, p21, disminuyó los niveles de p53 y de p-Rb, disminuyó los niveles de proteínas antiapoptóticas manteniendo invariable los de la proapoptótica y aumenta la actividad SA-β-Gal. Finalmente, el tratamiento con Navitoclax (1 μM) por 2 días no produjo cambio en las proteínas pro y antiapoptóticas, aunque disminuyó la actividad SA-β-Gal y no produjo cambio significativo en los niveles de p15-p16, p21, p-Rb ni p53. Se concluye que TGF-β1 induce diferenciación celular y senescencia en MFC de rata neonata en FBS 10% por 7 días evidenciado como aumento en: expresión de α-SMA, actividad SA-β-Gal, iCDKs y disminución en p-Rb. Además de un efecto senolítico de Navitoclax sobre MFC senescentes inducidos por TGF-β1 evidenciado por una disminución en la actividad SA-β-Gal a los 2 días de tratamiento.

The cardiac myofibroblast (CMF) is a differentiated cell derived from the cardiac fibroblast (CF), a key cell in the regulation of the extracellular matrix (ECM), this differentiation process occurs in different pathologies and is crucial in the development of cardiac fibrosis. When CFs differentiate into CMF, there is an increase in the levels of alpha-smooth muscle actin (α-SMA); this process is largely mediated by transforming growth factor beta 1 (TGF-β1), which is secreted in different contexts such as tissue repair, for example, in the case of heart infarction. This cytokine also promotes the differentiation of healthy cells to senescent cells characterized by an arrest of the cell cycle together with the development of a profibrotic microenvironment, originating an accumulation of senescent cells that together generate the so-called senescence-associated secretory phenotype (SASP), a set of cytokines, chemokines, and metalloproteases that interact on nearby cells modifying them to also transform into senescent cells. Lately a new class of drugs called senostatic and senolytic have been studied, the former blocks the action of SASP on other cells, and the latter eliminates senescent cells by apoptosis mechanisms, within which Navitoclax (ABT-263) emerges as a possible drug to eliminate these so-called "zombie" cells. Previous studies performed in our laboratory show a senolytic effect of Navitoclax on CMF, so the following hypothesis is proposed: Navitoclax reduces the number of senescent myofibroblasts and modifies the protein profile of the TGF-β1-induced SASP: 1) To obtain TGF-β1-induced senescent MFC. 2) To determine that Navitoclax decreases the number of MFC by an-apoptosis-associated mechanism. 3) To determine the cytokine profile of SASP (IL-6, IL-8, IL-1β, TNF-α and MCP-1) of CMF. 4) To verify that Navitoclax modifies the SASP of TGF-β1-induced CMF. As an experimental model, we used neonatal rat CFs treated with TGF-β1 (10 ng/mL) at 7 days, evaluating cell size, cell cycle protein levels, pro- and anti-apoptotic proteins, SA-β-Gal activity. Results: TGF-β1 increased the average cell size, increased the inhibitors of cyclin-dependent kinases (iCDK) p15-p16, p21, decreased the levels of p53 and p-Rb, decreased the levels of anti-apoptotic proteins keeping unchanged those of pro-apoptotic and increased the SA-β-Gal activity, all at 7 days. Finally, treatment with Navitoclax (1 μM) for 2 days produced no change in pro- and anti-apoptotic proteins, decreased SA-β-Gal activity, and produced no significant change in the levels of p15-p16, p21, p-Rb, or p53. It is concluded that TGF-β1 induces cell differentiation and senescence in neonatal rat CMF in 10% FBS for 7 days, evidenced by an increase in α-SMA expression, SA-β-Gal activity, iCDKs and decrease in p-Rb. In addition to a senolytic effect of Navitoclax on TGF-β1-induced senescent MFC evidenced by a decrease in SA-β-Gal activity at 2 days of treatment.