Estudio de la unión de anticuerpos de suero de pacientes pediátricos convalecientes de infecciones urinarias a dominios superficiales de los ujieres FimD y PapC de Escherichia coli uropatógena

Abstract

Las fimbrias son filamentos proteicos multiméricos que se localizan en la superficie bacteriana y que cumplen una función esencial en la adherencia de estos microorganismos a los tejidos de su hospedero. La mayoría de las fimbrias en las bacterias Gram negativo son ensambladas por el sistema chaperona-ujier (CU) en el que básicamente operan una o más proteínas chaperonas y un ujier, proteína transmembrana que actúa como plataforma de ensamblaje de la fimbria en la membrana externa. La fimbria tipo 1 y la fimbria P son las fimbrias más representativas y más estudiadas en los sistemas CU, en las que operan las proteínas ujier FimD y PapC, respectivamente. Ambas fimbrias desempeñan un papel importante en la adherencia de cepas de Escherichia coli uropatógenas (UPEC), que constituyen la principal causa de infecciones del tracto urinario (ITU) en humanos a nivel comunitario, afectando principalmente a niños y adultos mayores. Las fimbrias son estructuras determinantes en la patogenicidad bacteriana debido a la interacción que establecen con receptores en tejidos del hospedero y, al mismo tiempo, son determinantes de reconocimiento por parte del sistema inmunológico, particularmente por estar expuestas en la superficie bacteriana. En ese contexto, las subunidades estructurales fimbriales han sido los componentes más estudiados, en términos del reconocimiento por parte de anticuerpos y el efecto que esto conlleva en el desarrollo del ciclo patogénico. Sin embargo, las proteínas ujier tienen dominios expuestos a la superficie, que han sido mucho menos estudiados en estos aspectos. Dentro de los pocos antecedentes que existen, se ha demostrado que la proteína ujier YcbS de Escherichia coli une glicosaminoglicanos del hospedero y además es reconocida por anticuerpos en el contexto de una respuesta inmunológica. Esto daría cuenta de que los dominios superficiales de las proteínas ujier se encuentran accesibles y podrían representar puntos de unión con moléculas del hospedero. Por lo tanto, considerando la importancia de los sistemas fimbriales CU como factores de virulencia y como potenciales objetivos de terapias antivirulencia, resulta relevante profundizar en el estudio de la interacción de los ujieres con su organismo hospedero y, particularmente, estudiar el papel de los dominios superficiales. En este trabajo, se estudió la interacción de los dominios superficiales de FimD y PapC con anticuerpos presentes en sueros de pacientes pediátricos convalecientes de ITU causadas por UPEC. Para ello, se diseñó un modelo de expresión heteróloga de cada proteína en E. coli BL21ΔABCF (cepa cuádruple mutante, carente de porinas OmpA, LamB, OmpC y OmpF, diseñada especialmente para la expresión de proteínas tipo porinas), utilizando el vector pVB1. Se corroboró la identidad de los genes clonados mediante PCR, digestión enzimática y secuenciación de los insertos en el sitio de múltiple clonamiento de pVB1. La presencia de FimD y PapC se determinó en primera instancia en extractos bacterianos totales, mediante Western blot (WB), utilizando anticuerpos dirigidos contra los dominios superficiales de cada una de ellas. Estos anticuerpos fueron desarrollados previamente en conejos inmunizados con proteínas quiméricas sintéticas, que contenían los dominios más extensos de cada proteína, enlazados por linkers. Luego, se determinó la presencia de las proteínas en la membrana externa bacteriana mediante citometría de flujo, utilizando los mismos anticuerpos. Posteriormente, se determinó la reactividad de los anticuerpos contenidos en sueros de pacientes pediátricos convalecientes de ITU causadas por UPEC con los dominios superficiales de FimD y PapC de la cepa cuádruple mutante transformada con los plásmidos recombinantes con los respectivos genes mediante citometría de flujo. Se corroboró el correcto clonamiento de los genes fimD y papC en pVB1 mediante PCR y digestiones enzimáticas, obteniéndose productos de los tamaños esperados en todos los casos. Además, de forma complementaria, se verificó la identidad de los insertos por secuenciación a partir de los vectores recombinantes. Se confirmó la expresión de FimD en extractos totales por WB y en superficie por reactividad del anticuerpo anti-FimD, la cual mostró una reactividad significativamente mayor en comparación con las cepas control (cepa con el vector pVB1 vacío y sin el vector). No ocurrió lo mismo con PapC, caso en el que no se observó diferencias significativas con respecto a los controles. A continuación, al evaluar la reactividad de los sueros de pacientes pediátricos convalecientes de ITU causadas por UPEC con el sistema de expresión heteróloga de FimD en E. coli BL21ΔABCF, se observó una reactividad significativamente mayor en comparación con los controles (cepa con el vector pVB1 vacío y sin el vector). Para complementar este estudio, especialmente en el caso de PapC, se evaluó la reactividad de los sueros de pacientes pediátricos con las proteínas quiméricas de FimD y PapC. Los resultados mostraron reactividad en ambos casos. En base a la reactividad de los sueros de pacientes pediátricos convalecientes, tanto con la cepa que expresa FimD, como con las proteínas quiméricas de FimD y PapC, se puede concluir que existe una interacción de los dominios superficiales de dichos ujieres con anticuerpos presentes en sueros de pacientes pediátricos convalecientes de ITU. Estos hallazgos, sumados a otros antecedentes citados, no solo refuerzan la idea de que existe una interacción entre el hospedero y el patógeno a través de los ujieres, sino que, además, ésta se produce a través de los dominios superficiales de los ujieres. El efecto de esta interacción en la patogenicidad bacteriana y en el desarrollo de la respuesta inmune aún se debe dilucidar puesto que permitiría establecer a los dominios superficiales de FimD y PapC posible blanco terapéutico en el desarrollo de vacunas y fármacos contra la ITU causada por UPEC.

Fimbriae are multimeric protein filaments located on the bacterial surface that play an essential role in the adherence of these microorganisms to the tissues of their host. Most fimbriae in Gram-negative bacteria are assembled by the chaperone-usher (CU) system, which essentially consists of one or more chaperone proteins and an usher, a transmembrane protein that acts as an assembly platform for the fimbria in the outer membrane. Type 1 fimbria and P fimbria are the most representative and most studied fimbriae in the CU systems, in which the usher proteins FimD and PapC operate, respectively. Both fimbriae play an important role in the adherence of uropathogenic Escherichia coli (UPEC) strains, which are the main cause of community-acquired urinary tract infections (UTIs) in humans, mainly affecting children and older adults. Fimbriae are determinant structures in bacterial pathogenicity due to the interaction they establish with receptors in host tissues and, at the same time, are recognition determinants by the immune system, particularly because they are exposed on the bacterial surface. In this context, fimbrial structural subunits have been the most studied components in terms of antibody recognition and the effect this has on the development of the pathogenic cycle. However, usher proteins have surface-exposed domains, which have been much less studied in these aspects. Among the few existing precedents, it has been shown that the usher protein YcbS of Escherichia coli binds host glycosaminoglycans and is also recognized by antibodies in the context of an immune response. This would indicate that the surface domains of the usher proteins are accessible and could represent binding points with host molecules. Therefore, considering the importance of CU fimbrial systems as virulence factors and as potential antivirulence therapy targets, it is relevant to delve into the study of the interaction of the ushers with their host organism and, particularly, to study the role of the surface domains. In this study, the interaction of the surface domains of FimD and PapC with antibodies contained in sera from pediatric patients recovering from UTIs caused by UPEC was studied. For this, a heterologous expression model of each protein in E. coli BL21ΔABCF (a quadruple mutant strain, lacking the porins OmpA, LamB, OmpC, and OmpF, specially designed for the expression of porin-type proteins) was designed, using the pVB1 vector. The identity of the cloned genes was verified by PCR, enzymatic digestion, and sequencing of the inserts at the multiple cloning site of pVB1. The presence of FimD and PapC was initially determined in total bacterial extracts, by Western blot (WB), using antibodies directed against the surface domains of each of them. These antibodies were previously developed in rabbits immunized with synthetic chimeric proteins, which contained the most extensive domains of each protein, linked by linkers. Then, the presence of the proteins at the bacterial surface was determined by flow cytometry, using the same antibodies. Subsequently, the reactivity of the antibodies contained in sera from pediatric patients recovering from UTIs caused by UPEC with the surface domains of FimD and PapC, expressed in the quadruple mutant strain was determined by flow cytometry. The correct cloning of the fimD and papC genes in pVB1 was verified by PCR and enzymatic digestions, obtaining products of the expected sizes in all cases. In addition, the inserts of the recombinant vectors were sequenced as a complement. The expression of FimD in total extracts was confirmed by WB and on the surface by reactivity of the anti-FimD antibody, which showed significantly higher reactivity compared to control strains (strain with the empty pVB1 vector and without the vector). The same did not occur with PapC, in which no significant differences were observed compared to the controls. Next, when evaluating the reactivity of the sera from pediatric patients recovering from UTIs caused by UPEC with the heterologous expression system of FimD in E. coli BL21ΔABCF, significantly higher reactivity was observed compared to the controls (strain with the empty pVB1 vector and without the vector). To complement this study, especially in the case of PapC, the reactivity of the sera from pediatric patients with the chimeric proteins of FimD and PapC was evaluated. The results showed reactivity in both cases. Based on the reactivity of the sera from pediatric patients recovering, both with the strain expressing FimD and with the chimeric proteins of FimD and PapC, it can be concluded that there is an interaction of the surface domains of these ushers with antibodies present in sera from pediatric patients recovering from UTIs. These findings, combined with other cited precedents, not only reinforce the idea that there is an interaction between the host and the pathogen through the ushers, but also that this occurs through the surface domains of the ushers. The effect of this interaction on pathogenicity and cellular immunity still needs to be elucidated since it would allow establishing the surface domains of FimD and PapC as a possible therapeutic target in the development of vaccines and drugs against UTIs caused by UPEC.