Caracterización de versiones truncas de la proteína inmunogénica de superficie recombinante de Streptococcus agalactiae como agonistas de TLR-4

Abstract

Las vacunas han salvado millones de vidas en el mundo desde su invención, inicialmente con el uso de virus y bacterias atenuados o inactivados, que si bien inducen la activación del sistema inmune, estaban asociadas a la aparición de efectos secundarios. Además, que no conferían inmunidad a largo plazo. Hoy el desarrollo de nuevas vacunas basadas en subunidades o antígenos purificados solucionan el problema de la especificidad y reducción de efectos secundarios, pero tiene el problema de no ser tan inmunogénicos por lo que para su administración es necesaria la adición de adyuvantes para aumentar la respuesta inmune. Streptococcus agalactiae o estreptococo del grupo B (SGB) es un patógeno oportunista Gram positivo, anaerobio facultativo y β-hemolítico, es una bacteria comensal del tracto gastrointestinal y es el principal agente infeccioso causante de neumonía, sepsis y meningitis en recién nacidos, personas inmunocomprometidas y ancianos. La proteína inmunogénica de superficie (SIP) es una proteína con una masa molecular de 53 kDa que es conservada en todos los serotipos de SGB y es un antígeno con alta inmunogenicidad emergiendo como una atractiva y rentable opción de vacuna contra SGB. La inmunización subcutánea, intranasal y oral con SIP recombinante (rSIP) ha demostrado generar anticuerpos opsonofagocíticos específicos que confieren protección contra SGB en modelo in vitro e in vivo. Además, se demostró que la proteína rSIP es capaz de activar receptores tipo Toll TLR-2 y TLR-4, mostrando características principales de los adyuvantes ya que su activación conduce a una respuesta proinflamatoria y porque actúan sobre las células dendríticas (CDs) estimulando la sinapsis inmunológica en linfocitos T y particularmente rSIP estimula las células inmunitarias innatas como adyuvante para inducir respuestas inmunitarias adaptativas Th1. La mayoría de los agonistas de TLR-4 actualmente investigados para el desarrollo de adyuvantes, son componentes microbianos no proteicos, como lipopolisacáridos, oligonucleótidos y lipopéptidos, siendo el Monofosforil-lípido A (MPLA) el único aceptado en vacunas comerciales. Si bien estos agonistas han demostrado utilidad, es crucial continuar con el desarrollo de nuevos adyuvantes que superen las limitantes actuales. Alternativamente los adyuvantes proteicos han demostrado características principales de los adyuvantes de vacunas, además, presentan ventajas como la posibilidad de modificar su estructura para lograr una mayor inmunogenicidad y disminuir su toxicidad. También, un agonista proteico puede ser conjugado genéticamente con el antígeno, facilitando su administración conjunta, lo que podría mejorar la respuesta inmune. Por otro lado, esta entrega conjunta puede generar protección contra dos agentes patógenos. Adicionalmente, se ha reportado que fragmentos peptídicos derivados de proteínas inmunogénicas pueden exhibir una capacidad de activación equiparable o incluso superior a la proteína completa, además de presentar ventajas en cuanto a versatilidad para aplicaciones biotecnológicas. Por esto, es de suma importancia encontrar la región donde se encuentra el dominio de unión a TLR-4 presente en la proteína SIP y la importancia de su estructura nativa, por lo que en esta memoria se utilizaron proteínas truncadas de SIP como estrategia para analizar si mantienen su capacidad ligando y así estimar la secuencia de rSIP que activa TLR-4. En este estudio se expresaron heterologamente en E. coli BL21 (DE3) los 3 fragmentos de la proteína rSIP (SIP1-125, SIP1-251, SIP1-352) y se purificaron en condiciones nativas usando resina de ácido níquel-nitrilotriacético (NI-NTA) mediante cromatografía de baja presión y cromatografía líquida de alta precisión (HPLC) usando una columna de exclusión molecular. Se demostró mediante la cuantificación de la enzima reportera fosfatasa alcalina secretada (SEAP) en un cultivo de la línea celular HEK-Blue que el fragmento SIP1-251 en condiciones nativas es capaz de activar receptores TLR-4 de manera significativamente mayor que rSIP WT (alrededor de un 80% de activación comparado con el control positivo con lipopolisacáridos (LPS) frente a un 20-30% en el caso de la proteína WT en los receptores murino y humano respectivamente). También se determinó que la desnaturación de la proteína usando agentes caotrópicos, genera la pérdida de la activación de TLR-4 lo que sugiere que la estructura tridimensional es importante en la actividad agonista del fragmento. El alto potencial inmunoestimulador del fragmento SIP1-251 en comparación con SIP WT sugiere que un fragmento con menos aminoácidos podría aumentar la capacidad inmunoestimulante. Esto podría explicarse por una mayor exposición de la secuencia agonista o por un cambio de la conformación que favorece la interacción con el receptor. En consecuencia, resulta imperativo continuar investigando ya que, por ejemplo, la cristalización de la proteína SIP nos entregaría información valiosa sobre su plegamiento y conformación. Adicionalmente, caracterizar la respuesta inmune dependiente de SIP1-251 para evaluar su capacidad adjuvante mediante modelos de inmunización in vivo, evaluar su capacidad de inducir inmunidad celular y humoral contra un antígeno modelo.

Vaccines have saved millions of lives in the world since their invention, initially with the use of attenuated or inactivated viruses and bacteria, which although they induce the activation of the immune system, were associated with the appearance of side effects. In addition, they did not confer long-term immunity. Today, the development of new subunit or purified antigen-based vaccines solves the problem of specificity and reduction of side effects, but has the problem of not being as immunogenic, so for their administration it is necessary to add adjuvants to increase the immune response. Streptococcus agalactiae or group B streptococcus (GBS) is an opportunistic Gram-positive, facultative anaerobic and β-hemolytic pathogen, it is a commensal bacterium of the gastrointestinal tract and is the main infectious agent causing pneumonia, sepsis and meningitis in newborns, immunocompromised people, and the elderly. The surface immunogenic protein (SIP) is a 53 kDa molecular weight protein that is conserved in all GBS serotypes and is a highly immunogenic antigen emerging as an attractive and cost-effective vaccine option against GBS. Subcutaneous, intranasal and oral immunization with recombinant SIP (rSIP) has been shown to generate specific opsonophagocytic antibodies that confer protection against GBS in in vitro and in vivo models. In addition, it was shown that the rSIP protein is capable of activating Toll-like receptors TLR-2 and TLR-4, showing main characteristics of adjuvants since their activation leads to a proinflammatory response and because they act on dendritic cells (DCs) stimulating the immunological synapse in T lymphocytes and particularly rSIP stimulates innate immune cells as an adjuvant to induce adaptive Th1 immune responses. Most of the TLR-4 agonists currently under investigation for adjuvant development are non-protein microbial components, such as lipopolysaccharides, oligonucleotides and lipopeptides, with Monophosphoryl Lipid A (MPLA) being the only one accepted in commercial vaccines. Although these agonists have proven useful, it is crucial to continue with the development of new adjuvants that overcome current limitations. Alternatively, protein adjuvants have demonstrated main characteristics of vaccine adjuvants, and additionally, they present advantages such as the possibility of modifying their structure to achieve greater immunogenicity and decrease their toxicity. Also, a protein agonist can be genetically conjugated with the antigen, facilitating their co-administration, which could improve the immune response. On the other hand, this co-delivery can generate protection against two pathogens. Additionally, it has been reported that peptide fragments derived from immunogenic proteins can exhibit an activation capacity comparable or even superior to the full-length protein, and present advantages in terms of versatility for biotechnological applications. For this reason, it is of utmost importance to find the region where the TLR-4 binding domain is present in the SIP protein and the importance of its native structure, which is why in this work truncated SIP proteins were used as a strategy to analyze if they maintain their ligand capacity and thus estimate the rSIP sequence that activates TLR-4. In this study, the 3 fragments of the rSIP protein (SIP1-125, SIP1-251, SIP1-352) were heterologously expressed in E. coli BL21 (DE3) and purified under native conditions using nickel-nitrilotriacetic acid (Ni-NTA) resin by low-pressure chromatography and high-performance liquid chromatography (HPLC) using a size exclusion column. It was demonstrated by quantification of the secreted alkaline phosphatase reporter enzyme (SEAP) in a HEK-Blue cell line culture that the SIP1-251 fragment in native conditions is capable of activating TLR-4 receptors significantly higher than rSIP WT (around 80% activation compared to the positive control with lipopolysaccharides (LPS) versus 20-30% in the case of the WT protein in murine and human receptors, respectively). It was also determined that denaturation of the protein using chaotropic agents generates the loss of TLR-4 activation, suggesting that the three-dimensional structure is important in the agonist activity of the fragment. The high immunostimulatory potential of the SIP1-251 fragment compared to SIP WT suggests that a fragment with fewer amino acids could increase the immunostimulatory capacity. This could be explained by greater exposure of the agonist sequence or by a conformational change that favors interaction with the receptor. Consequently, it is imperative to continue researching since, for example, the crystallization of the SIP protein would provide valuable information about its folding and conformation. Additionally, characterize the immune response dependent on SIP1-251 to evaluate its adjuvant capacity through in vivo immunization models, evaluate its ability to induce cellular and humoral immunity against a model antigen.