Determinación del impacto antioxidante y anti-inflamatorio de quercetina y ácido caféico en células CACO_2

Abstract

El epitelio intestinal corresponde a la primera zona de contacto que establece una relación funcional entre los componentes dietarios y este nicho fisiológico. Es ampliamente aceptado que los compuestos fenólicos derivados de la dieta poseen un potencial antioxidante, sin embargo, el impacto sobre la homeostasis óxidoreducción de proteínas citoplasmáticas no ha sido evaluada en células intestinales vivas en tiempo-real. En este trabajo evaluamos el impacto antioxidante del ácido cafeico (CAPE, 10 M) y quercetina (Quer, 5 M) en células Caco-2 que expresan HyPer en su citoplasma, un biosensor equipado con un par de cisteínas oxidables por H2O2, cuya reducción a tioles depende de la actividad antioxidante celular. Complementariamente, evaluamos la abundancia de transcritos para tiorredoxina-1, peroxirredoxina-1 y superóxido dismutasa-1 por qPCR. La señal de HyPer en estado estacionario obtenida de células tratadas con Quer por 24 horas fue menor al control, efecto consistente con un aumento en la expresión del mensajero para tiorredoxina-1 y cuya actividad fue observada al registrar una reducción acelerada del biosensor oxidado. Células tratadas con CAPE mostraron una señal basal del biosensor mayor a la condición control, situación que se explica por un aumento de los mensajeros para superóxido dismutasa-1 y peroxiredoxina-1, que en conjunto favorecen la presencia de H2O2 y la transmisión de sus equivalentes oxidantes a la oxidación de cisteínas en el ambiente citoplasmático. Inesperadamente, el tratamiento con CAPE protegió al biosensor de la oxidación provocada por un pulso de H2O2 (50 M, 5 min), lo que invita a revisar los mecanismos relacionados con la permeabilidad a H2O2 de la membrana plasmática. En esta tesis también exploramos los niveles de transcritos para citoquinas proinflamatorias en células sometidas a H2O2 (500 M, 30 min) y pre-incubadas con los compuestos fenólicos mencionados, sin embargo, en nuestras condiciones experimentales no detectamos cambios para las IL-8, IL-1 e IL-25.El impacto diferencial de ambos compuestos fenólicos sobre la homeostasis redox de células epiteliales de intestino nos ha ayudado a entender mejor el efecto de estos compuestos sobre los componentes de la maquinaria redox. Las implicancias de estos cambios redox sobre la función de barrera podría ser investigado en modelos de estudio más complejos que permitan evaluar la interacción con comunidades microbianas, por ejemplo.

The intestinal epithelium is the first barrier that interacts with dietary compounds, modulating integrity and functionality of this epithelium. It is widely accepted that phenolic compounds might have an antioxidant potential, however, this property has not been evaluated regarding the oxido-reduction homeostasis of cytoplasmic proteins in intact intestinal cells. In this work, we evaluated the antioxidant impact in real-time of caffeic acid (CAPE, 10 M) and quercetin (Quer, 5 M) in Caco-2 cells expressing HyPer at cytoplasm, a redox biosensor carrying a pair of cysteines oxidized only by H2O2, which reduction to thiols depends of the antioxidant cellular activity. In addition, we evaluated the abundance of transcripts for thioredoxin-1, peroxirredoxin-1 and superoxide dismutase-1 by qPCR. The steady-state HyPer signal obtained in cells treated by 24 hours with Quercetin was lower than control cells, an effect that was consistent with an increase in the mRNA and activity of thiorredoxin-1, which was measured by recording an accelerated reduction in the oxidized biosensor. CAPE-treated cells showed a higher signal respect to control, a situation that might be explained by an increase in mRNAs for superoxide dismutase-1 and peroxirredoxin-1, which together favor the H2O2 presence and the transmission of its oxidant equivalent to the cysteine oxidation into the cytoplasmic environment. Unexpectedly, CAPE treatment protected the biosensor from the oxidation induced by a H2O2 pulse (50 M, 5 min), an observation that invites us to revisit the mechanisms involved in the H2O2 permeability at plasma membrane. In this thesis, we also explored the mRNA levels for pro-inflammatory cytoquines in Caco-2 cells subjected to H2O2 (500 M, 30 min) and pre-treated with the phenolic compounds mentioned, however, in our experimental conditions no changes were detected for IL-8, IL-1 y IL-25. The differential impact of both phenolic compounds on the redox homeostasis in epitelial cells from intestine helped us to understand better the effect of these compounds on each component of redox machinery. The implicances of these redox changes on the barrier function could be further investigated in more complex models that allow the study with microbial communities, for instance.