Caracterización cinética de mutantes del sitio alostérico para AMP en la enzima bifuncional fosfofructoquinasa/glucoquinasa de Methanothermococcus thermolithotrophicus

Abstract

Las arqueas metanogénicas son un grupo de organismos que se caracterizan por la producción de metano como producto final de metabolismo energético. La glicólisis en las arqueas presentan modificaciones de las vías clásicas de degradación del azúcar, como la vía Embden-Meyerhof-Parnas (EMP), por ejemplo, la fosforilación de la glucosa y fructosa-6-fosfato (F6P) se realiza por una glucoquinasa (ADP-GK) y una fosfofructoquinasa (ADP-PFK) empleando ADP en lugar de ATP como donante de fosforilo. En bacterias y eucariontes tanto las vías glicolítica como la gluconeogénica, son altamente reguladas por efectores alostéricos. Sin embargo, en el caso de las enzimas de arqueas, hasta hace poco, no se habían reportado efecto por los reguladores alostéricos descritos. En el contexto de nuestro laboratorio, se ha descrito que AMP es un activador de las actividades fosfofructoquinasa (PFK) y glucoquinasa (GK) en la enzima bifuncional fosfofructoquinasa/glucoquinasa dependiente de ADP de Methanococcus maripaludis (MmPFK/GK). Mediante estudios de reconstrucción de enzimas ancestrales, se determinó que la activación por AMP es un rasgo ancestral que se habría conservado dentro de los linajes de enzimas bifuncionales (PFK/GK) de los órdenes Methanococcales y Methanosarcinales. Recientemente, mediante cristalografía de rayos X, se resolvió la estructura tridimensional de la enzima bifuncional de Methanothermococcus thermolithotrophicus (MttPFK/GK) en la que AMP se encontró unido a un sitio diferente al sitio activo. A partir de análisis estructurales y evolutivos, se identificaron algunos residuos que interactúan con el AMP y que, a su vez, se encuentran conservados en las enzimas activadas por este ligando, los cuales son: tirosina 56, arginina 58, histidina 72 y serina 275. Para corroborar experimentalmente que el sitio encontrado mediante cristalografía es efectivamente el sitio alostérico para AMP, se propusieron las mutantes Y56A, R58A, R58E, H72A y S275A. Se espera que en estas mutantes la activación por AMP por en MttPFK/GK se vea alterada o ausente, sin alterar sus parámetros de cinéticos. La caracterización cinética de las proteínas mutantes mostró diferencias en los valores de Km o de Vmax en comparación a la enzima silvestre. Las mutantes R58E, R58A e Y56A presentaron disminución de las Vmax para todos sus sustratos, tanto para la actividad GK como PFK. Esto indicaría que el sitio activo estaría siendo afectado por las mutaciones generadas. Para el caso de la mutante H72A, se obtuvieron parámetros similares a la enzima silvestre. Las mutantes R58A, R58E e Y56A disminuyeron su activación por AMP en comparación a la enzima silvestre, mientras que la mutante H72A, presentó un comportamiento similar.

Methanogenic archaea are a group of organisms characterized by methane production as the final product of their energy metabolism. Glycolysis in archaea presents modified classical sugar degradation pathways, such as the Embden-Meyerhof-Parnas (EMP) pathway. For example, the phosphorylation of glucose and fructose-6-phosphate (F6P) is carried out by a glucokinase (ADP-GK) and a phosphofructokinase (ADP-PFK) using ADP instead of ATP as the phosphoryl donor. In bacteria and eukaryotes, both glycolytic and gluconeogenic pathways are highly regulated by allosteric effectors. However, until recently, no allosteric regulators had been reported for archaeal enzymes. In our laboratory, AMP has been described as an activator of the phosphofructokinase (PFK) and glucokinase (GK) activities in the bifunctional ADP-dependent phosphofructokinase/glucokinase enzyme from Methanococcus maripaludis (MmPFK/GK). Ancestral enzyme reconstruction determined that activation by AMP is an ancestral trait conserved within the lineages of bifunctional enzymes (PFK/GK) from the Methanococcales and Methanosarcinales orders. Recently, the three-dimensional structure of the bifunctional enzyme from Methanothermococcus thermolithotrophicus(MttPFK/GK) was resolved using X-ray crystallography, revealing that AMP was bound to a site distinct from the active site. Structural and evolutionary analyses identified several residues interacting with AMP, which are conserved in enzymes activated by this ligand: tyrosine 56, arginine 58, histidine 72, and serine 275. To experimentally confirm that the site identified through crystallography is indeed the allosteric site for AMP, the mutants Y56A, R58A, R58E, H72A, and S275A were constructed. These mutants are expected to show altered or absent activation by AMP in MttPFK/GK without affecting their kinetic parameters. Kinetic characterization of the mutant proteins showed differences in Km or Vmax values compared to the wild type. The mutants R58E, R58A, and Y56A showed decreased Vmax for both substrates, affecting both GK and PFK activities. This suggests that the generated mutations impact the active site. The H72A mutant exhibited parameters similar to the wild-type enzyme. The R58A, R58E, and Y56A mutants showed reduced activation by AMP compared to the wild-type enzyme, while the H72A mutant exhibited a similar behavior.