Desarrollo de un organismo genéticamente modificado en base a Lactococcus lactis que expresa la proteína inmunogénica de superficie de Streptococcus agalactiae

Abstract

Streptococcus agalactiae o Streptococcus del Grupo B (GBS, por sus siglas en inglés) es una bacteria que presenta 10 serotipos (Ia, Ib, II-IX), es comensal del tracto gastrointestinal humano y colonizadora el tracto genitourinario. En gestantes, se asocia a muerte fetal y parto prematuro y es el principal agente bacteriano asociado a sepsis, así como a meningitis y neumonía en recién nacidos. La infección se puede presentar como infección de inicio temprano (EOD por sus siglas en inglés) o como infección de inicio tardío (LOD por sus siglas en inglés). Los neonatos desarrollan EOD tras aspirar fluidos vaginales que presenten GBS durante el parto. Para las infecciones de LOD no está claro cómo es la adquisición del patógeno por parte del recién nacido. Actualmente, las infecciones de GBS se previenen mediante una profilaxis de antibióticos intraparto (IAP), pero esta estrategia solo previene las infecciones de tipo EOD. Por lo que las infecciones de LOD siguen siendo causa de mortalidad y morbilidad. Ante esto, la Organización Mundial de la Salud le ha dado prioridad al desarrollo de una vacuna contra GBS. Existen dos vacunas que se encuentran en Fase Clínica y varias en etapa preclínica de desarrollo. La Sección de Biotecnología del Instituto de Salud Pública de Chile se encuentra trabajando a nivel preclínico en una vacuna en base a la Proteína Inmunogénica de Superficie de GBS, conocida por su sigla en inglés como SIP. En este estudio, se trabajó con el propósito de obtener un organismo genéticamente modificado (GMO) en base a Lactococcus lactis con la capacidad de expresar y secretar la proteína SIP. Este GMO sería la base del desarrollo de una vacuna oral contra GBS. Como primer objetivo, se buscaba obtener el GMO en base a L. lactis, usando una estrategia de recombinación homóloga en dos pasos, que consiste en reemplazar el gen upp presente en L. lactis por el gen sip de GBS. Esta estrategia se basa en el uso del vector pMBsip. Este vector fue construido en base al vector pMBsacB. Como segundo objetivo, se buscaba evaluar la expresión y secreción de SIP por L. lactis. La estrategia de recombinación homóloga presentó inespecificidades en los brazos de homología. Dado esto, fue posible obtener un primer entrecruzamiento, pero no la mutante final. Ante esta dificultad, mediante análisis in silico se rediseñó la secuencia de ADN utilizada en la estrategia de recombinación homóloga. Esta nueva secuencia presenta una alta especificidad, siendo sintetizadas y entregadas las secuencias correspondientes mediante la empresa GenScript. Así, el propósito de esta Memoria de Titulo no se pudo lograr, pero se reconfiguró la estrategia inicial, obteniendo un nuevo diseño de secuencias de homología para la continuidad del proyecto.

Streptococcus agalactiae or Group B Streptococcus (GBS) is a bacterium that has 10 serotypes (Ia, Ib, II-IX), is a commensal of the human gastrointestinal tract and colonizes the genitourinary tract. In pregnant women, it is associated with fetal death and premature delivery and is the main bacterial agent associated with sepsis, as well as meningitis and pneumonia in newborns. The infection can present as early-onset infection (EOD) or late-onset infection (LOD). Neonates develop EOD after aspirating GBS-containing vaginal fluids during delivery. For LOD infections it is not clear how the newborn acquires the pathogen. Currently, GBS infections are prevented by intrapartum antibiotic prophylaxis (IAP), but this strategy only prevents EOD-type infections. Therefore, LOD infections continue to be a cause of mortality and morbidity. Given this, the World Health Organization has given priority to the development of a vaccine against GBS. There are two vaccines that are in the Clinical Phase and several in the preclinical stage of development. The Biotechnology Section of the Public Health Institute of Chile is working at the preclinical level on a vaccine based on the Surface Immunogenic Protein of GBS, known by its acronym in English as SIP. In this study, we worked with the purpose of obtaining a genetically modified organism (GMO) based on Lactococcus lactis with the capacity to express and secrete the SIP protein. This GMO would be the basis for the development of an oral vaccine against GBS. The first objective was to obtain the GMO based on L. lactis, using a two-step homologous recombination strategy, which consists of replacing the upp gene present in L. lactis with the GBS sip gene. This strategy is based on the use of the pMBsip vector. This vector was constructed based on the pMBsacB vector. The second objective was to evaluate the expression and secretion of SIP by L. lactis. The homologous recombination strategy presented non-specificities in the homology arms. Given this, it was possible to obtain a first cross, but not the final mutant. Faced with this difficulty, through in silico analysis the DNA sequence used in the homologous recombination strategy was redesigned. This new sequence presents a high specificity, the corresponding sequences being synthesized and delivered by the company GenScript. Thus, the purpose of this Title Report could not be achieved, but the initial strategy was reconfigured, obtaining a new design of homology sequences for the continuity of the project.