El régimen de linfodepleción con ciclofosfamida perjudica la protección inmune antitumoral a largo plazo mediado por la terapia celular adoptiva en un modelo in vivo de melanoma murino

Abstract

El cáncer se caracteriza por la división celular descontrolada y diseminación a otros tejidos, y este se ha transformado en la principal causa de muerte a nivel mundial. En Chile se diagnosticaron 54.000 casos de cáncer, junto con una mortalidad de más de 28.000 personas durante el año 2020, posicionando a esta enfermedad en un problema de salud pública nacional. El melanoma resulta de la proliferación descontrolada de melanocitos ubicados en el estrato basal de la piel y una vez que el melanoma se vuelve metastásico, el pronóstico de los pacientes es muy desfavorable. Dentro de las terapias disponibles, la inmunoterapia ha sido muy prometedora. Los linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTLs) son importantes para una respuesta inmune efectiva contra el cáncer. Las células dendríticas activan a los linfocitos T CD8+ vírgenes a través de la presentación antigénica y, en consecuencia, estos se diferencian a CTLs. Posteriormente, estos son capaces de migrar a otros tejidos, reconocer y eliminar a células tumorales a través de la liberación de perforinas y granzimas o la secreción de citoquinas como TNF-α e IFN-γ, que median la actividad antitumoral. Sin embargo, la expresión de receptores inhibitorios como PD-1 limita la actividad citotóxica de los CTLs a través de la interacción con su proteína ligando PD-L1. Además, la estimulación crónica del receptor de célula T (TCR) produce un perfil de agotamiento en los CTLs. A pesar de esto, recientemente se ha encontrado un estado más progenitor, que se caracteriza por la expresión del factor de transcripción TCF-1 y se ha denominado linfocitos T CD8+ progenitores exhaustos (Tpex). Luego, estos pueden diferenciarse a linfocitos T CD8+ terminalmente diferenciados (Tdiff), que median una respuesta antitumoral aguda. En conjunto, ambas poblaciones entregan una respuesta antitumoral efectiva y duradera. La terapia celular adoptiva (ACT) consiste en la transfusión autóloga de linfocitos T previamente activados in vitro que presentan reactividad antitumoral. Esta ha demostrado una eficacia notable en canceres hematológicos, sin embargo, en tumores sólidos, hay un gran porcentaje de pacientes que no responden a la terapia. Por esta razón, una estrategia que se utiliza regularmente en la clínica es un régimen de linfodepleción previo a la ACT. La ciclofosfamida (Cy) es una droga quimioterapéutica que provoca la apoptosis de células altamente proliferativas y se utiliza como agente linfodepletante. Sin embargo, esta puede tener un efecto perjudicial en los pacientes y en su sistema inmune endógeno. Por esta razón, esta tesis buscó explorar el efecto de un régimen de linfodepleción con Cy sobre las células inmune endógenas, las células transferidas y la eficacia de la ACT. Para esto, se utilizó un modelo de melanoma murino el cual recibió un régimen de linfodepleción con Cy y se determinó su impacto sobre las células inmunes a través de citometría de flujo. Añadido a esto, se evaluó la eficacia de la ACT a través de curvas de crecimiento tumoral y análisis de sobrevida. El régimen de linfodepleción con Cy elimina a linfocitos T CD8+ y células dendríticas convencionales de tipo 1 (cDC1), tanto en tumor como en nódulo drenante de tumor (dLN). Además, los linfocitos T CD8+ que logran infiltrar en el tumor no adquieren un perfil reactivo contra el tumor Tpex o Tdiff. Por otro lado, una ACT eficaz aumenta los linfocitos T CD8+ endógenos intratumorales, en cambio, el régimen de linfodepleción con Cy elimina a los linfocitos T CD8+ endógenos e induce la expansión de los linfocitos transferidos, tanto en sangre periférica como en el tumor. En consecuencia, el régimen de linfodepleción con Cy mejora la eficacia de una ACT subóptima, no obstante, ante un redesafío tumoral con una mutante de escape antigénica, se pierde la protección inmune antitumoral a largo plazo otorgada por una ACT eficaz. Estos resultados demuestran el doble rol del régimen de linfodepleción con Cy, el cual favorece la expansión de las células transferidas y el rechazo tumores primarios, pero perjudica la inmunidad antitumoral a largo plazo, lo que en última instancia puede favorecer la resistencia a la ACT.

Cancer is characterized by uncontrolled cell division and dissemination to other tissues. Unfortunately, it has become the leading cause of death worldwide. In Chile, 54,000 cases of cancer were diagnosed along with a mortality of more than 28,000 people during 2020, making this disease a national public health problem. Melanoma results from the uncontrolled proliferation of melanocytes located in the basal layer of the skin and once melanoma becomes metastatic, the prognosis for patients is very poor. Among the available therapies, immunotherapies have shown great promise. Cytotoxic CD8+ T lymphocytes (CTLs) are important for an effective immune response against cancer. Dendritic cells activate naive CD8+ T lymphocytes through antigen presentation and consequently they differentiate into CTLs. Subsequently, CTLs can migrate to peripheral tissues, recognize and eliminate tumor cells by producing perforins and granzymes or secreting cytokines such as TNF-α and IFN-γ, which mediate antitumor activity. However, the expression of inhibitory receptors such as PD-1 limits the cytotoxic activity of CTLs through interaction with their ligand PD-L1. Furthermore, chronic activation of the T cell receptor (TCR) leads to an exhaustion profile of CTLs. However, a progenitor state characterized by the expression of the transcription factor TCF-1 has recently been identified and named exhausted progenitor CD8+ T cells (Tpex). They then differentiate into terminally differentiated CD8+ T cells (Tdiff) that mediate an acute antitumor response. Together, both populations provide an effective and long-lasting antitumor response. Adoptive cell therapy (ACT) consists of the autologous transfusion of previously in vitro activated T lymphocytes with antitumor reactivity. It has shown remarkable efficacy in hematological cancers, but in solid tumors there is a large percentage of patients who do not respond to ACT. For this reason, a strategy often used in the clinic is the lymphodepletion regimen prior to ACT. Cyclophosphamide (Cy) is a chemotherapeutic drug that induces apoptosis of highly proliferative cells and is used as a lymphodepleting agent. However, it can have a detrimental effect on patients and their endogenous immune system. Therefore, this study explore the effect of a lymphodepletion regimen with Cy on endogenous immune cells, transferred cells and the efficacy of ACT. For this purpose, a murine melanoma model was used that received a lymphodepletion regimen with Cy, and the effect on immune cells was determined by flow cytometry. In addition, the efficacy of ACT was assessed by tumor growth curves and survival analysis. The lymphodepletion regimen with Cy eliminates CD8+ T lymphocytes and type-I conventional dendritic cells (cDC1), both in the tumor and in the tumor-draining lymph node (dLN). Moreover, CD8+ T lymphocytes infiltrating the tumor do not acquire a tumor-reactive profile assessed as Tpex or Tdiff phenotypes. On the other hand, an effective ACT increases intratumoral endogenous CD8+ T lymphocytes, whereas the lymphodepletion regimen with Cy eliminates endogenous CD8+ T lymphocytes and induces the expansion of the transferred lymphocytes, both in the peripheral blood and in the tumor. Finally, although the lymphodepletion regimen with Cy improves the efficacy of suboptimal ACT, the long-term antitumor immune protection afforded by effective ACT is lost. These results demonstrate the dual role of the Cy, which promotes the expansion of transferred cells and primary tumor rejection, but impairs long-term antitumor immunity, which may ultimately promote resistance to ACT.