Desarrollo de un sistema de liberación colónica basado en nanoemulsiones que comprende como sistema surfactante nanocomplejos solubles de quenopodina/alginato-Tween 80 útil para el tratamiento de la enfermedad inflamatoria intestinal

Abstract

La enfermedad inflamatoria intestinal (EII) es una patología de etiología compleja, que comprende principalmente a la colitis ulcerosa (CU) y la enfermedad de Crohn (EC), provocando procesos inflamatorios a nivel de la mucosa del colon o de forma transmural a lo largo del tracto gastrointestinal (GI), respectivamente. Entre los principales cambios fisiológicos a nivel colónico se presenta la disminución de la mucosa, alto estrés oxidativo, reducción de pH y disbiosis microbiana. En la actualidad existen diferentes protocolos terapéuticos que utilizan fármacos antiinflamatorios y antimicrobianos para controlar la EII, sin embargo, la administración sistemática de estos fármacos provoca efectos adversos que limitan su uso y el cumplimiento del tratamiento (dolor abdominal, mareos, vómitos, otros). Los fitoquímicos son una alternativa interesante que pueden ayudar a disminuir los procesos inflamatorios, alto estrés oxidativo y disbiosis microbiana a nivel colónico. La quercetina (Qt) es un flavonoide con capacidad antioxidante y antiinflamatoria reconocida, propiedades que lo convierten en una alternativa eficaz para mitigar la EII, sin embargo, su uso está limitado por su baja solubilidad en agua. En ese sentido, el objetivo principal de este estudio fue desarrollar nanoemulsiones (NEs) utilizando un sistema surfactante (QPA/Tw80) compuesto por el complejo soluble de quenopodina-alginato (QPA) y Tween 80 (Tw80), para la liberación controlada a nivel colónico de Qt, activada por bacterias de la microbiota colónica. El estudio inicio con el aislamiento de la globulina 11S o quenopodina (QP) de quinoa mediante un sistema escalable de ultrafiltración de flujo cruzado, utilizando membranas de 100 y 30 kDa (0,02 m2 de area). QP aislada se mezcló con alginato comercial de baja viscosidad para la formación del complejo soluble QPA. Las NEs se formularon utilizando diferentes proporciones del sistema surfactante QPA/Tw80 (F1Qt a F6Qt), donde F4Qt (60/40) y F5Qt (70/30) mostraron tamaños menores a 260 nm, PDI <0,27 y una eficiencia de encapsulación (EE) mayor a 85%. Se utilizo F1Qt (0/100) como control por tener Tw80 como único surfactante. La estabilidad de las NEs se evaluó a diferentes condiciones (tiempo, temperatura, pH y concentración de NaCl). La mayor estabilidad se alcanzó a temperatura de refrigeración de 4°C hasta los 30 días de estudio, sin embargo, presento menor estabilidad a concentraciones mayores de 200mM de NaCl y pH (2-5) cercanos al pI (4,5) de QP y pKa (3-3,5) del alginato. En ese sentido, se prepararo P4Qt y P5Qt como control del poder surfactante de la proteina, reemplazando el complejo QPA por QP (QP/Tw80). Se completo el estudio con los análisis DSC y ATR-FTIR, que indicaron interacciones por puente de hidrogeno e hidrofóbicas entre el complejo QPA y Qt. F4Qt, F5Qt, P4Qt y P5Qt fueron desafiados frente a medios colónicos simulados (buffers y microbiota colónica). Se mostró una mayor liberación de Qt en los buffers PBS1X y Krebs a pH 5,4 (colon enfermo) en comparación con la liberación de Qt a pH 7,4 (colon saludable). En presencia de E. coli y B. thetaiotaomicron, desencadenaron una liberación significativa de Qt (ƒ2<50) en comparación con el control (sin bacterias). El estudio de la cinética de liberación indicó que F1Qt presento una liberación Qt según el modelo de Higuchi, mientras que F4Qt y P4Qt ajustaron mejor al modelo de Korsmeyer-Peppas. Las NEs control (sin Qt) no mostraron citotoxicidad en las células HT-29, y las NEs cargadas con Qt disminuyeron la viabilidad de las células de carcinoma de colon de manera dependiente a la dosis de Qt aplicada (2-40 μM). Adicionalmente, la capacidad antioxidante ABTS y ORAC de la Qt encapsulada se incrementaron al utilizar el sistema surfactante QPA en la preparación de las NEs. A nivel intracelular, el método de oxidación de diacetato de diclorofluoresceína (DCFH-DA) evidenció que 80 μM de Qt encapsulado en F4Qt y P4Qt, fueron capaces de atenuar por completo el efecto oxidativo de 120 μM de H2O2 añadido al sistema de cultivo. F1Qt, F4Qt y P4Qt fueron encapsuladas en micropartículas de alginato por gelificación iónica con CaCl2 (2%, p/v) para formar los nuevos sistemas de entrega de nanopartículas en micropartículas (NiMDS). Los NiMDS presentaron tamaños de 258,9, 261,4 y 255,8 μm, respectivamente, con valores span menores a 1,5. Se añadió un recubrimiento entérico de shellac a las micropartículas de alginato por el método de inmersión (solución al 10%(p/p)), buscando evitar la liberación prematura (gástrica) de Qt. El recubrimiento formo una estructura core-shell con un espesor de 9 a 12 μm, provocando un incremento total del diámetro de las micropartículas de 7 a 10 %. S_MA_F1Qt, S_MA_F4Qt y S_MA_P4Qt fueron evaluados frente a un sistema de digestión gastrointestinal in vitro, simulando la etapa gástrica, intestinal y colónica. Las NiMDS recubiertas con shellac presentaron una liberación de 2,77 %, 1,65 y 1,89% en la fase gástrica, evitando la liberación prematura de Qt y reduciendo más de 10 veces su liberación en comparación a las NEs sin microencapsular. Sin embargo, en la fase colónica, solo incrementaron los porcentajes de liberación a 11,66, 8,08 y 9,84%, respectivamente. Los resultados obtenidos muestran la factibilidad para preparar NEs utilizando sistemas surfactantes como QPA/Tw80 y QP/Tw80, que son capaces de liberar compuestos hidrofóbicos (Qt) de manera controlada a nivel colónico en cuadros de la EII. F4Qt y P4Qt pueden ser considerados como nanovehiculos interesantes en la industria alimentaria, como suplementos alimentarios, y farmacéutica en el tratamiento de las EII y otras enfermedades relacionadas a cuadros inflamatorios.

Inflammatory bowel disease (IBD) is a pathology of complex etiology, which mainly includes ulcerative colitis (UC) and Crohn's disease (CD), causing inflammatory processes at the level of the colon mucosa or transmurally along the gastrointestinal (GI) tract, respectively. Among the main physiological changes at the colonic level are a decrease in mucosa, high oxidative stress, reduced pH, and microbial dysbiosis. Currently, different therapeutic protocols use anti-inflammatory and antimicrobial drugs to control IBD however the systematic administration of these drugs causes adverse effects that limit their use and compliance with treatment (abdominal pain, dizziness, vomiting, others). Phytochemicals are an interesting alternative that can help reduce inflammatory processes, high oxidative stress, and microbial dysbiosis at the colonic level. For example, quercetin (Qt) is a flavonoid with recognized antioxidant and anti-inflammatory capacity, making it an effective alternative to mitigate IBD, however, its use is limited by its low solubility in water. In this sense, the main objective of this study was to develop nanoemulsions (NEs) using a surfactant system (QPA/Tw80) composed of the soluble complex of chenopodin-alginate (QPA) and Tween 80 (Tw80) for the controlled release of Qt at the colonic level, activated by bacteria from the colonic microbiota. The study started with isolating 11S globulin or chenopodin (QP) from quinoa using a scalable cross-flow ultrafiltration system, using 100 and 30 kDa membranes (0.02 m2 area). Isolated QP was mixed with low-viscosity commercial alginate for the formation of the soluble QPA complex. NEs were formulated using different proportions of the QPA/Tw80 surfactant system (F1Qt to F6Qt), where F4Qt (60/40) and F5Qt (70/30) showed sizes smaller than 260 nm, PDI <0.27 and an encapsulation efficiency (EE) greater than 85%. F1Qt (0/100) was used as a control because it had Tw80 as the only surfactant. The stability of the NEs was evaluated under different conditions (time, temperature, pH, and NaCl concentration). The highest stability was achieved at a refrigeration temperature of 4°C for up to 30 days of study, however, it showed lower stability at concentrations higher than 200 mM of NaCl and pH (2-5) close to the pI (4.5) of QP and pKa (3-3.5) of alginate. In this sense, P4Qt and P5Qt were prepared to control the surfactant power of the protein, replacing the QPA complex with QP (QP/Tw80). The study was completed with DSC and ATR-FTIR analyses, which indicated hydrogen bond and hydrophobic interactions between the QPA complex and Qt. F4Qt, F5Qt, P4Qt, and P5Qt were challenged against simulated colonic media (buffers and colonic microbiota). Higher Qt release was shown in PBS1X and Krebs buffers at pH 5.4 (diseased colon) compared to Qt release at pH 7.4 (healthy colon). In the presence of E. coli and B. thetaiotaomicron, they triggered significant Qt release (ƒ2<50) compared to the control (without bacteria). The release kinetics study indicated that F1Qt presented a Qt release according to the Higuchi model, while F4Qt and P4Qt better fit the Korsmeyer-Peppas model. NEs control (without Qt) did not show cytotoxicity in HT-29 cells, and Qt-loaded NEs decreased the viability of colon carcinoma cells in a dose-dependent manner of Qt applied (2-40 μM). Additionally, the ABTS and ORAC antioxidant capacity of the encapsulated Qt was increased by using the QPA surfactant system in the preparation of the NEs. At the intracellular level, the dichlorofluorescein diacetate oxidation method (DCFH-DA) showed that 80 μM of Qt encapsulated in F4Qt and P4Qt were able to completely attenuate the oxidative effect of 120 μM of H2O2 added to the culture system. F1Qt, F4Qt, and P4Qt were encapsulated in alginate microparticles by ionic gelation with CaCl2 (2%, w/v) to form the new nanoparticle-in-microparticle delivery systems (NiMDS). The NiMDS presented sizes of 258.9, 261.4, and 255.8 μm, respectively, with span values less than 1.5. An enteric shellac coating was added to the alginate microparticles by the immersion method (10% (w/w) solution), seeking to avoid premature (gastric) release of Qt. The coating formed a core-shell structure with a thickness of 9 to 12 μm, causing a total increase in the diameter of the microparticles of 7 to 10 %. S_MA_F1Qt, S_MA_F4Qt, and S_MA_P4Qt were evaluated against an in vitro gastrointestinal digestion system, simulating the gastric, intestinal, and colonic stages. The shellac-coated NiMDS presented a release of 2.77%, 1.65 and 1.89% in the gastric phase, avoiding the premature release of Qt and reducing its release by more than 10 times compared to non-microencapsulated NEs. However, in the colonic phase, the release percentages only increased to 11.66, 8.08, and 9.84%, respectively. The results obtained show the feasibility of preparing NEs using surfactant systems such as QPA/Tw80 and QP/Tw80, which are capable of releasing hydrophobic compounds (Qt) in a controlled manner at the colonic level in IBD. F4Qt and P4Qt can be considered interesting nanovehicles in the food industry, as food supplements, and pharmaceuticals in the treatment of IBD and other diseases related to inflammatory conditions.