Rol de los monosacáridos en la formación de biopelículas de sulfobacillus y en la producción de sustancias poliméricas extracelulares

Abstract

Sulfobacillus es un género bacteriano acidófilo, que participa en operaciones de biolixiviación que ocurren entre los 40° y 60°C. Este género se diferencia de gran parte de sus contrapartes mesófilas al poseer un metabolismo de tipo mixótrofo. Los microorganismos lixiviantes son capaces de formar biopelículas en sulfuros metálicos, proceso de gran relevancia en las etapas iniciales de la biolixiviación. La formación de biopelículas depende de la producción de sustancias poliméricas extracelulares (EPS), que generan una matriz compuesta en gran parte de polisacáridos. En la presente tesis, se realizó un análisis in silico de los genomas de Sulfobacillus acidophilus DSM 10332T y Sulfobacillus thermosulfidooxidans DSM 9293T y se identificaron transportadores putativos de azúcares y nucleósidos o nucleobases. En total se identificaron 8 transportadores MFS de tipo sugarporter putativos, 5 sistemas ABC putativos del tipo CUT1 y 3 del tipo CUT2 por cada especie. También se identificó un transportador putativo de la familia PTS en S. acidophilusT. Adicionalmente, se identificaron 10 transportadores putativos pertenecientes a la familia de los NCS-1 (Nucleobase Cation Symporter 1) en S. thermosulfidooxidansT y 6 en S. acidophilusT. Posteriormente, se ensayó la adición de diferentes monosacáridos y se cuantificó la adhesión celular y la formación de biopelículas por microscopía de epifluorescencia (EFM), acoplada a metodologías de análisis masivo de imágenes. Se observó un aumento significativo en la formación de biopelículas tras adicionar ribosa, en el caso de S. thermosulfidooxidansT, y tras adicionar ribosa, xilosa o trehalosa, en el caso de S. acidophilusT. Adicionalmente se probó la adición de ácido desoxirribonucleico (ADN) y se observó un aumento significativo en la formación de biopelículas en ambas especies. Finalmente, se realizó un análisis de FLBA (Fluorescently labeled lectin binding assays) acoplado a EFM, para observar cualitativamente la composición y distribución de los polisacáridos en la matriz de la biopelícula. La unión de lectinas permitió observar un aumento en la producción de polisacáridos capsulares y extracelulares en todas las condiciones de estudio, consecuente con el aumento en la adhesión celular. Las lectinas ConA (Concanavalina A), ECA (Lectina de Erythrina cristagalli) y GNA (Lectina de Galanthus nivalis) se unieron a residuos de polisacáridos capsulares y a residuos de polisacáridos coloidales en biopelículas de S. acidophilusT y S. thermosulfidooxidansT. Los resultados del FLBA sugieren que los polisacáridos capsulares visualizables mediante esta técnica en Sulfobacillus se componen principalmente de N-acetilglucosamina, N-acetilgalactosamina y galactosa, mientras que el EPS coloidal posee residuos de α-glucosa y galactosa. En resumen, en la presente tesis demostramos a nivel in silico y experimental que Sulfobacillus posee la capacidad de captar azucares y productos de la degradación de ácidos nucleicos para utilizarlos en la formación de biopelículas y en la síntesis de EPS. Este trabajo pone en evidencia la complejidad metabólica de Sulfobacillus y presenta una aproximación para estudiar los procesos de formación de biopelículas de bacterias acidófilas in situ.

Sulfobacillus is an acidophilic bacterial genus involved in bioleaching operations that take place between 40°C and 60°C. Unlike many of its mesophilic counterparts, this genus exhibits a mixotrophic metabolism. Bioleaching microorganisms can form biofilms on metal sulfides, a process that is highly relevant in the initial stages of bioleaching. Biofilm formation depends on the production of extracellular polymeric substances (EPS), creating a matrix largely composed of polysaccharides. This thesis presents an in silico analysis of the genomes of Sulfobacillus acidophilus DSM 10332T and Sulfobacillus thermosulfidooxidans DSM 9293T. Putative transporters for sugars, nucleosides and nucleobases were identified. A total of 8 putative MFS sugarporter transporters, 5 putative CUT1-type ABC systems, and 3 CUT2-type systems were identified for each species. Additionally, a putative PTS transporter was identified in S. acidophilusT. Furthermore, 10 putative transporters were found in S. thermosulfidooxidansT and 6 in S. acidophilusT, all belonging to the NCS-1 (Nucleobase Cation Symporter 1) family. Subsequently, the addition of different monosaccharides was tested. Cell adhesion and biofilm formation were quantified by means of epifluorescence microscopy (EFM), combined with massive image analysis methodologies. A significant increase in biofilm formation was observed after the addition of ribose in the case of S. thermosulfidooxidansT, and after the addition of ribose, xylose, or trehalose in the case of S. acidophilusT. Additionally, the addition of deoxyribonucleic acid (DNA) was tested, resulting in a significant increase in biofilm formation in both species. Finally, a FLBA (Fluorescently Labeled Lectin Binding Assay) analysis coupled with EFM was performed to qualitatively observe the composition and distribution of polysaccharides in the biofilm matrix. Lectin binding revealed an increase in the production of capsular and extracellular polysaccharides under all study conditions, consistent with increased cell adhesion. The lectins ConA (Concanavalin A), ECA (Erythrina cristagalli lectin), and GNA (Galanthus nivalis lectin) bound to capsular polysaccharide residues and colloidal polysaccharide residues in the biofilms of S. acidophilusT and S. thermosulfidooxidansT. The FLBA results suggest that Sulfobacillus capsular polysaccharides are mainly composed of N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, and galactose, while colloidal EPS contains α-glucose and galactose residues. In summary, our results show that Sulfobacillus is able to uptake sugars and nucleic acid degradation products for their use in biofilm formation and EPS biosynthesis. This work highlights the metabolic complexity of Sulfobacillus and provides an approach to study in situ biofilm formation processes in acidophilic bacteria.