Uso de láminas bucky paper de nanotubos de carbono de pared múltiple con derivados nitro aromáticos para la determinación de NADH

Abstract

La modificación de electrodos de carbono vítreo (ECV) con nanotubos de carbono (CNT) y otros nanomateriales es una metodología utilizada para mejorar la sensibilidad, selectividad, transferencia electrónica y reducir los sobrepotenciales. Uno de los procedimientos más empleados para este fin es la técnica Dropcasting (DC), que consiste en depositar una alícuota de una dispersión de CNTs sobre la superficie activa del ECV. Tras un período de secado, se genera un recubrimiento heterogéneo que varía entre electrodos modificados, lo que resulta en una falta de repetibilidad para las mediciones de los electrodos ECV/CNTs(DC). Para abordar este problema, se propone como alternativa el uso de pequeñas láminas Bucky-paper (BP) adheridas directamente sobre el ECV, las cuales aportan homogeneidad y reproducibilidad a la superficie modificada. En esta tesis, se da a conocer un nuevo procedimiento para modificar la superficie electródica de los electrodos de carbono vítreo (CV) mediante el uso de films BP compuestos por nanotubos de carbono de pared múltiple (MWCNTs), y poliestireno de bajo peso molecular (PS) como aditivo estructural para mejorar la homogeneidad de la dispersión de MWCNTs y la estabilidad de las láminas BP, obteniendo de esta forma electrodos del tipo CV/MWCNTs(BP). La interfase modificada del ECV/MWCNTs(BP) permite la adsorción del nitrocompuesto aromático (NAC) 4-(piren-1-il) butil-3,5-dinitrobenzoato (3,5-DNBpy), seleccionado como analito de estudio. Se investigó la reducción electroquímica del compuesto NAC adsorbido en la interfase electródica generando el par redox hidroxilamina/nitroso (R-NHOH/R-NO), que ha demostrado un efecto electrocatalítico favorable en el proceso de oxidación de ciertas biomoléculas, como la β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH). La introducción y retención del 3,5-DNBpy en el ECV/MWCNTs(BP) se logra mediante la técnica de inmersión, la cual se monitorea utilizando voltametría cíclica (VC). Se llevó a cabo una caracterización superficial de las láminas BP mediante técnicas como la microscopía de barrido electroquímico (SECM), microscopía electrónica de barrido (SEM), microscopía de fuerza atómica (AFM), espectroscopía Raman y ángulo de contacto (AC). Adicionalmente, se describió el comportamiento resistivo de estos films mediante espectroscopía de impedancia electroquímica (EIS). Finalmente, se aborda la aplicación práctica de estos electrodos CV/MWCNTs(BP)-3,5-DNBpy como un potencial biosensor. Donde se realiza un análisis cuantitativo del cofactor enzimático β-nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) reducido y su obtención in vitro. Para la etapa in vitro se emplearon los reactivos: β-nicotinamida adenina dinucleótido oxidado (NAD+), alcohol deshidrogenasa (ADH) y etanol, obteniendo un comportamiento lineal entre 0,4 – 3,4 μM. Mientras que para NADH reducido, se obtiene un comportamiento lineal entre 0,07 – 0,6 mM en las curvas de calibración. El límite de detección para ambos casos fue de 0,122 μM (reducido) y 65 μM (in vitro) respectivamente. Adicionalmente, se logra la incorporación de la enzima ADH al electrodo CV/ MWCNTs(BP)-3,5-DNBpy mediante la técnica de inmersión. Donde se informa de un comportamiento lineal entre 0,068 – 0,603 mM para la determinación de NADH reducido in vitro usando el ECV/MWCNTs(BP)-3,5-DNBpy/ADH y un LOD = 0,076 mM.

The modification of glassy carbon electrodes (GCE) with carbon nanotubes (CNT) and other nanomaterials, is a methodology used to improve sensitivity, selectivity, electronic transfer capabilities and reduce overpotentials. One of the most used procedures for this purpose is the Dropcasting technique (DC), which consists in depositing an aliquot of a CNTs dispersion on the active surface of the ECV. After a drying period, a heterogeneous coating is generated that varies between modified electrodes, which results in a lack of repeatability in measurements for the electrodes GCE/CNTs(DC). To address this issue, as an alternative the use of small Bucky-paper (BP) sheets adhered directly on the ECV is proposed, which provides homogeneity and reproducibility to the modified surface. In this thesis, a new procedure is proposed to modify the electrodic surface of GC electrodes through the use of BP films composed of multi walled carbon nanotubes (MWCNTs), and low molecular weight polystyrene (PS) as a structural additive to improve homogeneity in the MWCNTs dispersion and structural stability of BP sheets, thus obtaining GC/MWCNTs(BP) type electrodes. The modified GCE/MWCNTs(BP) interface allows the adsorption of the nitroaromatic compound (NAC) 4-(pyren-1-yl) buytl-3,5-dinitrobenzoate (3,5-DNBpy), selected as the target analyte. The electrochemical reduction of the NAC adsorbed at the electrodic interphase was investigated, generating the redox pair hydroxylamine/ nitroso (-NHOH/-NO), which has demonstrated a favorable electrocatalytic effect in the oxidation process of certain biomolecules, such as β-nicotineamide adenine dinucleotide (NADH). The introduction and retention of 3,5-DNBpy in the GCE/MWCNTs(BP) is achieved through the immersion technique, which is monitored using cyclic voltammetry (CV). A surface characterization of the BP sheets was carried out using techniques such as electrochemical scanning electron microscope (SECM), scanning electron microscope (SEM), atomic force microscopy (AFM), Raman spectroscopy and contact angle (AC). Additionally, the resistive behavior of these films was described by electrochemical impedance spectroscopy (EIS). Finally, the practical application of these GC/MWCNTs(BP)-3,5-DNBpy electrodes as a potential biosensor is addressed. A quantitative analysis of the reduced enzymatic cofactor β-nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) and its production in vitro is realized. For the in vitro stage, the following reagents were used: oxidized β-nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+), alcohol dehydrogenase (ADH) and ethanol, obtaining a linear behavior between 0,4 - 3,4 μM. While for reduced NADH, a linear behavior is obtained between 0,07 – 0,6 mM in the calibration curves. The detection limit for both cases are of 0,122 μM (standard) and 65 μM (in vitro) respectively. Additionally, the incorporation of the enzyme ADH into the electrode GC/MWCNTs(BP)-3,5-DNBpy was achieved through the immersion technique. Where a lineal behavior is reported between 0,068 – 0,603 mM for the in vitro determination of NADH using the GCE/MWCNTs(BP)-3,5-DNBpy/ADH and a LOD = 0,076 mM.