Estudio de la expresión génica en cultivos celulares de músculo esquelético estimulados por despolarización

Abstract

El ejercicio y la estimulación eléctrica, que involucra despolarización de membrana, conducen a una adaptación funcional del músculo esquelético. El proceso adaptativo incluye hipertrofia y activación de mecanismos oxidativos, los que van acompañados de un incremento en la expresión génica, que se traduce en la síntesis de proteínas musculares específicas. Sin embargo, los mecanismos moleculares asociados a estas respuestas adaptativas aún no están totalmente dilucidados. Trabajos previos de nuestro laboratorio han demostrado que al despolarizar miotubos de músculo esquelético de rata y miotubos de la línea celular de ratón C2C12 ya sea con una elevada concentración de K+ o mediante estimulación eléctrica, estos responden con un aumento bifásico en la concentración de Ca+2 intracelular. El primer aumento o señal rápida de Ca+2 se localiza en el citoplasma y sería responsable del proceso contráctil. El segundo aumento o señal lenta de Ca+2 se asocia a los núcleos. La señal lenta de Ca+2 intracelular se genera a través de la liberación de Ca+2 por canales que responden a IP3 (IP3R). Estudios realizados en miotubos de la línea celular C2C12 sometidos a despolarización, indican que al utilizar agentes que inhiben la vía de inositol-1,4,5 trisfosfato (IP3) por distintos mecanismos, tales como 2-aminoetoxidifenil borato (2-APB), xestospongina C y U73122, la señal lenta de Ca+2 intracelular es inhibida completamente, sin afectar la señal rápida. El significado fisiológico de la señal lenta de Ca+2 se desconoce, pero se postula que estaría involucrada en la activación de factores transcripcionales y en la consecuente regulación de la expresión génica. En este sentido, nuestro laboratorio ha señalado que la despolarización de células de músculo esquelético produce un aumento transitorio en la expresión de los genes tempranos c-fos, c-jun y egr-1, en la que participa la señal lenta de Ca+2. Hasta la fecha se han realizado pocos estudios que describan los cambios en la expresión génica en respuesta a la despolarización en células musculares, y ningún estudio que relacione la señal lenta de Ca+2 intracelular con la expresión de genes específicos del músculo esquelético. Nuestro trabajo inicial se centró en el estudio de la expresión del gen que codifica para Interleuquina-6 (IL-6), basándonos en antecedentes de la literatura que describen que el ejercicio produce un incremento en la concentración plasmática de esta citoquina. Además, el gen de IL-6 posee en su promotor varias secuencias de consenso que pueden ser moduladas por Ca+2. Mediante RT-PCR demostramos que la despolarización con K+ 84mM de miotubos de rata y de células C2C12, aumenta el nivel de mRNA de IL-6 con una inducción máxima de 3,5 veces entre 3 y 4 hrs, efecto que no depende del Ca+2 extracelular. El tratamiento de las células con BAPTA-AM, quelante intracelular de Ca+2 o con inhibidores de la señal lenta de Ca+2, tales como 2APB, xestospongina C y U73122, disminuyen la inducción de IL-6 en células despolarizadas. Al despolarizar miotubos transfectados con un gen reportero de luciferasa que contiene un fragmento de 651 bp del promotor de IL-6, se observó un aumento de 2 veces en la actividad del promotor en relación a miotubos no estimulados. Este aumento persiste en miotubos tratados con rianodina 25μM, pero disminuye significativamente en presencia de 2-APB y U73122. Mutaciones en los sitios NF-κB y AP-1, presentes en el promotor de IL-6, disminuyen la expresión del gen reportero inducida por K+. En conjunto, estos resultados sugieren la participación de la señal lenta de Ca+2 en la activación transcripcional de IL-6 en miotubos despolarizados con K+, y de NF-κB y AP-1 como elementos regulatorios. Para identificar otros genes que se expresan diferencialmente en respuesta a la despolarización, se realizaron experimentos mediante la técnica de Microarrays de oligonucleótidos (Compugen 22K, 21.920 genes), utilizando el RNA total de miotubos de células C2C12 despolarizados con K+ 84 mM por 5 min, recolectado entre las 2 a 24 horas post-estímulo. De los análisis mediante la base de datos del NCI-CIT, identificamos un total de 127 genes que presentan un aumento o disminución de su expresión de al menos 1,7 veces con respecto al control sin estímulo, en el transcurso del período de 24 h. Se observaron cambios significativos en genes involucrados en respuesta a estrés, metabolismo y comunicación celular, entre otros. Dentro de los genes que se expresan diferencialmente por efecto de la despolarización, figuran el de α-actina esquelética (Acta1) y el de troponina I (Tnni), que codifican proteínas estructurales de músculo. El análisis por microarrays indica que ambos genes presentan su máxima inducción a las 4 horas después de la despolarización, lo que se confirmó mediante RT-PCR. La despolarización con K+ 84mM de miotubos de rata y miotubos de células C2C12 produce un aumento en el nivel de mRNA de 1,5 veces para Tnni y 2 veces para Acta1. El pre-tratamiento de los miotubos con 2-APB o U73122 no afecta la inducción en la expresión de Acta1, pero si disminuye la de Tnni, lo que sugiere la participación de la señal lenta de Ca+2 en la regulación de la expresión génica de Tnni, pero no de Acta1. La importancia de este estudio es que constituye el primer trabajo que demuestra directamente la participación de las señales de Ca+2 intracelular, mediadas por IP3R, como factor de señalización de vías que llevan a la expresión de genes tardíos específicos, tales como IL-6 y Tnni, en células de músculo esquelético sometidas a despolarización. Además, esta tesis destaca porque se encontró un modelo que se presta muy bien para el estudio de la expresión génica mediante la técnica de Microarrays, que permite estudiar efectivamente la relación entre los cambios de potencial y la expresión génica en células de músculo esquelético. Las células musculares con sólo un cambio de potencial de membrana como estímulo, muestran cambios consistentes en una cantidad limitada de genes, lo que permitirá estudiar los mecanismos involucrados en su regulación.