Caracterización metodológica para la obtención de un perfil transcriptómico específico en zonas enriquecidas de soma y dendritas de la región CA1 en el hipocampo dorsal de ratas hembras

Abstract

Se ha demostrado en el último tiempo que diversas patologías presentan un sesgo con respecto al sexo biológico del individuo. Una de ellas es el trastorno depresivo mayor (MDD), el cual en mujeres se observa una prevalencia de aproximadamente dos veces más en comparación con hombres. Sin embargo, no se han realizado muchos estudios que profundicen con respecto a los cambios moleculares asociados que expliquen dicha disparidad. Existen modelos animales de estrés crónico, como por ejemplo murinos, que han podido emular un comportamiento de tipo depresivo. Asimismo, se ha observado que el estrés crónico promueve una afectación diferenciada entre machos y hembras en diversas zonas del cerebro, una de las cuales corresponde al hipocampo dorsal. El hipocampo es una estructura cerebral fundamental en la memoria y presenta una alta plasticidad sináptica; procesos que dependen de la localización y traducción de ARNm en compartimentos neuronales específicos. En particular, las dendritas y el soma presentan diferencias en la expresión y regulación de transcritos que pueden influir en la función sináptica y la respuesta al estrés. Sin embargo, la caracterización específica del transcriptoma local en estos compartimentos y cómo este se ve afectado por efectos del estrés ha sido poco explorada. Esta memoria de título busca estandarizar una metodología para la microdisección y análisis transcriptómico de regiones somáticas y dendríticas en la región CA1 del hipocampo dorsal de ratas hembras. De esta manera poder identificar diferencias en la expresión de genes asociados a la plasticidad neuronal y evaluar el impacto del estrés crónico en la distribución de transcritos. Para lo anterior se utilizaron ratas Sprague-Dawley hembras, las cuales se dividieron en dos grupos, uno de ellos se mantuvo en condiciones basales y el otro fue expuesto a un protocolo de estrés por restricción durante 14 días. A su vez se optimizó un protocolo de microdisección que permitió separar mecánicamente compartimentos somáticos de la neuropila de la región CA1. Posteriormente se realizó la extracción y purificación del ARN, seguido de la evaluación de su integridad por medio de Fragment Analyzer. Asimismo se realizó la extracción y purificación de proteínas. Finalmente, mediante RT-qPCR y Western Blot se realizó la verificación de la correcta disección de los distintos estratos a través de marcadores somáticos y dendríticos. Posteriormente se realizó un análisis transcriptómico utilizando por medio de la secuenciación directa del ARN con la tecnología de Nanopore para ambas condiciones. Los resultados mostraron una separación eficiente de los compartimentos somáticos y neuropila a nivel de transcrito y proteico. Por otro lado se identificaron genes diferencialmente expresados entre soma y dendrita, donde muchos de ellos están involucrados en la plasticidad sináptica y remodelación del citoesqueleto. Finalmente, el estrés crónico alteró la distribución de ciertos transcritos, afectando su localización en las dendritas, lo cual sugiere un posible impacto en la función sináptica. En conclusión los resultados confirmaron que la metodología desarrollada permitió obtener perfiles transcriptómicos diferenciados, a su vez se logró confirmar que el estrés crónico modula el transcriptoma neuronal de manera compartimentalizada, afectando la localización de genes claves para la plasticidad sináptica. Todo lo anterior representa una herramienta útil para futuras investigaciones sobre la regulación subcelular de la expresión génica en el cerebro y así determinar de manera más detallada los cambios producidos por el estrés.

In recent years, various pathologies have been shown to exhibit a bias concerning the biological sex of individuals. One such condition is Major Depressive Disorder (MDD), which has a prevalence approximately twice as high in women compared to men. However, few studies have explored the molecular changes underlying this disparity. Animal models of chronic stress, such as murine models, have successfully replicated depression-like behaviors. Furthermore, sex-dependent effects have been observed in different brain regions, one of which is the dorsal hippocampus. The hippocampus is a fundamental brain structure involved in memory and synaptic plasticity, processes that rely on the localization and translation of mRNAs in specific neuronal compartments. In particular, dendrites and the soma exhibit differences in transcript expression and regulation, which may influence synaptic function and stress responses. However, the specific characterization of the local transcriptome in these compartments and how it is affected by stress remains largely unexplored. This thesis aims to standardize a methodology for the microdissection and transcriptomic analysis of somatic and dendritic regions in the CA1 region of the dorsal hippocampus in female rats. The goal is to identify differences in the expression of genes associated with neuronal plasticity and to evaluate the impact of chronic stress on transcript distribution. For this purpose, female Sprague-Dawley rats were divided into two groups: one maintained under basal conditions and the other subjected to a 14-day restraint stress protocol. A microdissection protocol was optimized to mechanically separate somatic compartments from the neuropil in the CA1 region. Subsequently, RNA was extracted and purified, followed by integrity assessment using a Fragment Analyzer. Additionally, proteins were extracted and purified. Finally, RT-qPCR and Western Blot were performed to verify the proper dissection of different strata using somatic and dendritic markers. A transcriptomic analysis was then conducted through direct RNA sequencing using Nanopore technology under both conditions. The results demonstrated efficient separation of somatic and neuropil compartments at both the transcript and protein levels. Furthermore, differentially expressed genes were identified between the soma and dendrites, many of which are involved in synaptic plasticity and cytoskeletal remodeling. Lastly, chronic stress altered the distribution of certain transcripts, affecting their localization in dendrites, suggesting a potential impact on synaptic function. In conclusion, the results confirmed that the developed methodology allowed for the generation of distinct transcriptomic profiles. Additionally, it was established that chronic stress modulates the neuronal transcriptome in a compartmentalized manner, affecting the localization of key genes involved in synaptic plasticity. Altogether, these findings provide a valuable tool for future research on the subcellular regulation of gene expression in the brain, facilitating a more detailed understanding of stress-induced molecular changes.